Microbacterium sp.XT11黄原胶内切酶在毕赤酵母中的异源表达、性质及应用.docx

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1、Microbacteriumsp. XT11黄原胶内切酶在毕赤酵母中的异源表达、性质及应用黄原胶是由野油菜黄单抱菌分泌的一种胞外杂多糖，主链由以BT,4糖昔键相连的葡萄糖构成，甘露糖一葡萄糖一甘露糖组成其侧链，分子质量一般为21065107Dalo研究发现，由黄原胶降解而来的低分子质量黄原胶可以抑制软骨细胞凋亡2、治疗骨关节炎3,还具有抗氧化活性4、抑菌5、清除自由基6等功效，具有较高的市场价值。因此，通过降解黄原胶生产低分子质量黄原胶具有重要的意义。常见的多糖降解方法有物理法，化学法和生物酶法7。相对于物理法和化学法，生物酶法反应条件温和、过程可控,Microbacteriumsp. XT1

2、1黄原胶内切酶在毕赤酵母中的异源表达、性质及应用黄原胶是由野油菜黄单抱菌分泌的一种胞外杂多糖，主链由以BT,4糖昔键相连的葡萄糖构成，甘露糖一葡萄糖一甘露糖组成其侧链，分子质量一般为21065107Dalo研究发现，由黄原胶降解而来的低分子质量黄原胶可以抑制软骨细胞凋亡2、治疗骨关节炎3,还具有抗氧化活性4、抑菌5、清除自由基6等功效，具有较高的市场价值。因此，通过降解黄原胶生产低分子质量黄原胶具有重要的意义。常见的多糖降解方法有物理法，化学法和生物酶法7。相对于物理法和化学法，生物酶法反应条件温和、过程可控,琼脂粉(固体培养基)，高压蒸汽灭菌(115七，20min) oBMGY 培养基(g/

3、L)： 10 酵母膏，20 蛋白陈，13. 4YNB, 4X10-4生物素，10甘油，100mmolL磷酸钾缓冲液(pH6.0),高压蒸汽灭菌(115C, 20min) oBMMY 培养基(g/L)： 10 酵母膏，20 蛋白陈，13. 4YNB, 4X10-4生物素，5甲醇，100mmolL磷酸钾缓冲液(pH6.0),高压蒸汽灭菌(115C, 20min) oBSM 培养基：26.7mLL85%H3P04 , 0.93gLCaS04 ,18. 2gLK2S04, 14. 9gLMgS04 7H20, 4. 13gLK0H, 40gL甘油，4. 35mLLPMTlo1. 1.3主要试剂限制性内

4、切酶(EcoRI、Notl. Sad. Sall. BamHI). DNA 胶回收试剂盒，美国 Thermo 公司；TaqPremix、DNAMaker、DNA连接酶(SolutionI), TaKaRa公司(大连)；Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、氨羊青霉素、遗传霉素(G418)、琼脂糖，生工生物工程(上海)股份有限公司。1.1.4仪器与设备C1000TouchTM 型 PCR 仪、MicroPulserTM 型电转仪，美国Bio-Rad公司；KTA蛋白纯化系统，美国GEHealthcare公司；TU-1810分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。琼脂粉(固体培养

5、基)，高压蒸汽灭菌(115七，20min) oBMGY 培养基(g/L)： 10 酵母膏，20 蛋白陈，13. 4YNB, 4X10-4生物素，10甘油，100mmolL磷酸钾缓冲液(pH6.0),高压蒸汽灭菌(115C, 20min) oBMMY 培养基(g/L)： 10 酵母膏，20 蛋白陈，13. 4YNB, 4X10-4生物素，5甲醇，100mmolL磷酸钾缓冲液(pH6.0),高压蒸汽灭菌(115C, 20min) oBSM 培养基：26.7mLL85%H3P04 , 0.93gLCaS04 ,18. 2gLK2S04, 14. 9gLMgS04 7H20, 4. 13gLK0H,

6、40gL甘油，4. 35mLLPMTlo1. 1.3主要试剂限制性内切酶(EcoRI、Notl. Sad. Sall. BamHI). DNA 胶回收试剂盒，美国 Thermo 公司；TaqPremix、DNAMaker、DNA连接酶(SolutionI), TaKaRa公司(大连)；Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、氨羊青霉素、遗传霉素(G418)、琼脂糖，生工生物工程(上海)股份有限公司。1.1.4仪器与设备C1000TouchTM 型 PCR 仪、MicroPulserTM 型电转仪，美国Bio-Rad公司；KTA蛋白纯化系统，美国GEHealthcare公司；

7、TU-1810分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。琼脂粉(固体培养基)，高压蒸汽灭菌(115七，20min) oBMGY 培养基(g/L)： 10 酵母膏，20 蛋白陈，13. 4YNB, 4X10-4生物素，10甘油，100mmolL磷酸钾缓冲液(pH6.0),高压蒸汽灭菌(115C, 20min) oBMMY 培养基(g/L)： 10 酵母膏，20 蛋白陈，13. 4YNB, 4X10-4生物素，5甲醇，100mmolL磷酸钾缓冲液(pH6.0),高压蒸汽灭菌(115C, 20min) oBSM 培养基：26.7mLL85%H3P04 , 0.93gLCaS04 ,18. 2gLK2S0

8、4, 14. 9gLMgS04 7H20, 4. 13gLK0H, 40gL甘油，4. 35mLLPMTlo1. 1.3主要试剂限制性内切酶(EcoRI、Notl. Sad. Sall. BamHI). DNA 胶回收试剂盒，美国 Thermo 公司；TaqPremix、DNAMaker、DNA连接酶(SolutionI), TaKaRa公司(大连)；Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒、质粒小量抽提试剂盒、氨羊青霉素、遗传霉素(G418)、琼脂糖，生工生物工程(上海)股份有限公司。1.1.4仪器与设备C1000TouchTM 型 PCR 仪、MicroPulserTM 型电转仪，美国Bio

9、-Rad公司；KTA蛋白纯化系统，美国GEHealthcare公司；TU-1810分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。1.2实验方法L2.6黄原胶内切酶活力和蛋白浓度的测定酶反应体系(5mL)为2gL黄原胶，10olL磷酸钠缓冲液(pH6. 0),适量酶液。于40。下反,10min,沸水浴10min终止反应，DNS法测定反应体系中还原糖浓度16,空白为灭活的酶液。酶活定义：每分钟释放1 molL还原糖所需的黄原胶内切酶酶量为1U。利用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度16 o1. 2.7黄原胶内切酶酶学性质研究为测定黄原胶内切酶的最适pH,用10mmolL不同pH(3. 09.0)的磷酸钠缓冲液测定酶

10、活力，以最高酶活力为100%,计算各pH下的相对酶活力。测定pH稳定性时，用上述缓冲液稀释酶液，并在41下放置3h,按标准方法测定酶活力，以未经处理的黄原胶内切酶酶液为100%,计算各pH下的残余酶活力。为测定重组黄原胶内切酶最适温度，在207(TC测定黄原胶内切酶酶活力，以最高酶活力为100%,计算各温度下的相对酶活力。测定温度稳定性时，将适当稀释后的酶液于207(TC保温3h后测定酶活力，以未经处理的黄原胶内切酶酶液为100%,计算各温度下的残余酶活力。1.2. 8低分子质量黄原胶的制备将2gL原胶溶解于10olL磷酸钠缓冲液(pH6. 0)中，加入足量的黄原胶内切酶，4(C反应5h,水解

11、产物经Sevage法17除蛋白，加入一定体积的无水乙醇醇沉，得到水解产物。采用高效体积排阻色谱(high-performancesizeexclusionchromatograph , HPSEC)测定其分子质量。2结果与分析2. 1黄原胶内切酶的表达与纯化Microbacteriumsp. XT11来源的黄原胶内切酶基因(EX,GenBank：ALX66163. 1)全长 2856bp,编码 951 个氨基酸,针对毕赤酵母偏好性，对黄原胶内切酶基因进行密码子优化,优化后密码子的适应指数从0. 49升到0.88,平均GC含量（DNA4种碱基中，鸟嘿吟和胞嘴喔所占的比率）从67. 3%调整至 4

12、4.3%,并避免了 EcoRI、Notl. SacE Sall、BamHI 等常用酶切位点。重组质粒pPIC9K-EX的验证结果如图2-a所示，其单酶切结果与重组质粒pPIC9K-EX的大小相符，双酶切及PCR结果均在2800bp左右出现明显条带，与黄原胶内切酶基因大小一致，随后的测序验证表明重组质粒pPIC9K-EX构建成功。以同样的方法验证重组质粒pGAP9K-EX（图2-b）,最后的测序验证表明重组质粒pGAP9bEX构建成功。将验证成功的重组质粒pPIC9K-EX. pGAP9K-EX分别线性化后导入毕赤酵母感受态细胞，经筛选最终得到16株重组毕赤酵母-pPIC9K-EX和15株重组毕

13、赤醉母pGAP9K-EXo将重组毕赤酵母摇瓶发酵后测定其酶活力，由图2-c可以看出，以A0X1为启动子的物。采用高效体积排阻色谱(high-performancesizeexclusionchromatograph , HPSEC)测定其分子质量。2结果与分析2. 1黄原胶内切酶的表达与纯化Microbacteriumsp. XT11来源的黄原胶内切酶基因(EX,GenBank：ALX66163. 1)全长 2856bp,编码 951 个氨基酸,针对毕赤酵母偏好性，对黄原胶内切酶基因进行密码子优化,优化后密码子的适应指数从0. 49升到0.88,平均GC含量（DNA4种碱基中，鸟嘿吟和胞嘴喔所

14、占的比率）从67. 3%调整至 44.3%,并避免了 EcoRI、Notl. SacE Sall、BamHI 等常用酶切位点。重组质粒pPIC9K-EX的验证结果如图2-a所示，其单酶切结果与重组质粒pPIC9K-EX的大小相符，双酶切及PCR结果均在2800bp左右出现明显条带，与黄原胶内切酶基因大小一致，随后的测序验证表明重组质粒pPIC9K-EX构建成功。以同样的方法验证重组质粒pGAP9K-EX（图2-b）,最后的测序验证表明重组质粒pGAP9bEX构建成功。将验证成功的重组质粒pPIC9K-EX. pGAP9K-EX分别线性化后导入毕赤酵母感受态细胞，经筛选最终得到16株重组毕赤酵母

15、-pPIC9K-EX和15株重组毕赤醉母pGAP9K-EXo将重组毕赤酵母摇瓶发酵后测定其酶活力，由图2-c可以看出，以A0X1为启动子的Fig. 2ConstruetionandscreeningofrecombinantPichiapastorisM-蛋白质Marker； 1、3-原始毕赤酵母；2-重组毕赤酵母-pPIC9K-EX-8 ； 4-重组毕赤酵母-PGAP9K-EX-12；5-重组毕赤酵母-pPIC9K-EX-8 ；6-重组毕赤酵母-pGAP9K-EX-l 2a-重组毕赤酵母发酵上清液；b-纯化后图3SDS-PAGE检测重组黄原胶内切酶的表达和纯化Fig. 3SDS-PAGEanalysisofendoxanthanaseexpressionandpurification2. 2重组毕赤酵母的发酵条件优化毕赤酵母对不同外源蛋