重组菌转化木犀草素生成3’O甲基化木犀草素的研究.docx
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1、重组菌转化木犀草素生成3,-0-甲基化木犀草素的研究摘要:通过几种带有甲基转移酶基因的质粒进行重组菌的构建,并通过酶活的测定筛选出表达较好的甲基转移酶并构建重组菌,对筛选出的甲基转移酶进行表达上的条件优化,主要是通过转化天然底物类黄酮木犀草素生成甲基化木犀草素,确定重组菌最优转化效率的条件:以最优的转化条件进行高密度发酵,进一步提高其产量和转化率。关键词:重组菌、甲基化木犀草素、全细胞转化。1材料与方法1.1 重组质粒转化大肠杆菌表达宿主感受态细胞热激转化取11重组质粒于801E.co1iB121(DE3)感受态细胞中,轻轻混匀,冰上静置Iomin。将感受态细胞置于42。C水浴中热激2min,
2、然后冰浴5min。加入1m1预热的SOC培养基混合,37。C摇床中震荡培养30min。菌液均匀涂布在含重组质粒所带抗性的1B平板上,在37。C恒温培养箱中倒置培养至长出单菌落。重组质粒PCDFDUet-PFOMT和PACYCDUet-SAMS-S共转化大肠杆菌E.co1iB121(DE3)获得重组菌B121-PFOMT-SAMS-S。1.2 重组菌转化木犀草素为3253035。C和40。C)转化24h后用于HP1C测定。(3)重组菌转化最适木犀草素底物浓度将冷冻保存的重组菌B12I-PfOMT-SAMS-S接种到1B试管中(50gm1盐酸大观霉素),37。C过夜活化培养,将已活化的菌种分别接种
3、到10根试管中,设置底物木犀草素的终浓度分别为200mg1,400mg/1、800mg11.6g/1和2g1,转化温度设定为30久,进而转化木犀草素生产30甲基化木犀草素,转化时间24h后用于HP1C测定。(4)最适DMSo比例将冷冻保存的重组菌B12I-PfOMT-SAMS-S接种到1B试管中(50gm1盐酸大观霉素),37。C过夜活化培养,将已活化的菌种分别接种到10根试管中,设定DMSo的比例分别为1%、3%、5%、7%和9%,两组平行实验,转化温度设定为3(TC,进而转化木犀草素生产3,-0-甲基化木犀草素,转化时间24h后用于HP1e测定。(5)最适初始生物量OD6oonm将冷冻保存
4、的重组菌B12I-PfOMT-SAMS-S接种到1B试管中(50gm1盐酸大观霉素),37。C过夜活化培养,将已活化的菌种分别接种到10根试管中,于37。C摇床18OrPm培养,当初始ODeoonm分别为0.6,0.8,1.0,1.4,1.6和2.0的不同生物量阶段中,加入诱导剂IPTG浓度为0.2mM,DMSO比例为3%,0.3g/1的SAM,底物木犀草素终浓度为400mg1,设置转化温度为30。C的条件下转化木犀草素生产30-甲基化木犀草素,转化时间24h后用于HP1C测定。(6)重组菌转化最适诱导时机将冷冻保存的重组菌B12I-Pfomt-SAMS-S接种到1B试管中(50gm1盐酸大观
5、霉素),37。C过夜活化培养,将已活化的菌种分别接种到10根试管中,之后在诱导时间分别为Oh、3h、6h、9h、12h的不同产酶时间下再添加DMSo为3%,0.3g/1的SAM,底物终浓度800mg/1的条件下转化木犀草素生产3。O-甲基化木犀草素,转化时间24h后用于HP1C测定。(7)重组菌转化最适碳源培养优化将冷冻保存的重组菌B12I-Pfomt-SAMS-S接种到1B试管中(50gm1盐酸大观霉素),37。C过夜活化培养,将已活化的菌种接种到分别含有1%的甘油、糊精、麦芽糊精、菊粉、葡萄糖不同碳源的TB5m1试管中,37。C摇床18OrPm培养,初始OD600nm为1.4,加入诱导剂I
6、PTG浓度0.2mM,之后于产酶时间3h后添加DMSO比例为3%,0.3g/1的SAM,底物终浓度800mg/1的条件下转化木犀草素生产3。O-甲基化木犀草素,转化时间24h后用于HP1C测定。1.3 重组菌转化木犀草素生成3。O-甲基化木犀草素的反应时间曲线将冷冻保存的重组菌B12I-Pfomt-SAMS-S接种到5m1的1B试管中(50gm1盐酸大观霉素),37过夜活化培养,将已活化的菌种接种到含有1%的甘油碳源的25Om1TB培养基中,37C摇床18OrPm培养,初始OD600nm为1.4,加入诱导剂IpTG浓度0.2mM,在诱导3h后添加DMSO比例为3%,0.3g/1的SAM,底物终
7、浓度1g/1的条件下转化木犀草素生产30-甲基化木犀草素,30摇床转化时间分别为12h、24h、36h、48h和60h下进行取样,之后以5倍体积的甲醇加入取样液中终止反应,1200OrPm离心5min取上清液,之后过0.22m有机相滤膜后用于HP1C测定。2结果与分析2.1 重组菌B121-PFOMT-SAMS-S合成3,-0.甲基化木犀草素的条件优化2.1.1 最适反应温度和诱导剂IPTG浓度3502025303540Temperature()300250200150IOO500图2-15温度对转化的影响不同温度不同诱导剂IPTG培养下,3。0.甲基化木犀草素的产量结果如图2-15所示。图中
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