新冠核酸检测技术PCR实验室质量体系文件第三部份项目类SOP.docx

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1、临床基因扩增实验室标准操作程序目录编号名称页面第一部分管理类SOPSOP18-1临床基因诊断实验室设置及管理4-10SOP_18-2实验室人员的配置及培训程序11-12SOP_18-3手套使用及左右手分开的原则13-13SOP_18-4实验室台面摆放顺序程序14-14SOP18-5实验室内务管理制度15-15SOP18-6实验室清洁制度16-16SOP_18-7实验耗材的购买、质检和储存程序17-19SOP_18-8仪器申请、采购、验证和管理程序20-20SOP_18-9试剂的质检标准操作程序21-21SOP18-10实验室残留试剂药品、废弃物处理程序22-22S0P8Tl实验室生物防护程序2

2、3-23S0P_18-12PCR实验室仪器故障、试剂耗材发生质量问题的应急处置程序24-25S0P_18-13抱怨的处理程序26-27S0P_18-14实验室记录的管理28-29SOP18-15实验室化学试剂的管理及配置标准操作程序30-32S0P8T6标本的采集、验收和保存的标准操作程序33-35S0P_18-17标本与扩增板次唯一标识编号程序36-36S0P_18-18实验室室内质量控制标准操作程序37-38S0P_18-19实验室室间质量评价标准操作程序39-39SOP_18-20新型冠状病毒核酸检测结果分析与报告管理及可疑、阳性结果讨论审签制度40-48SOP_18-21新型冠状病毒核

3、酸检测疑似阳性结果、可疑结果处置应急预案49-53第二部分仪器类SOPSOP18-22移液器使用、维护与校准标准操作程序54-55SOP18-23移动紫外线消毒车使用、维护与校准操作程序56-56S0P_18-24传递窗操作程序57-57SOP8-25生物安全柜使用、维护与校准操作程序58-60SOP_18-26CleancubeMini过氧化氢空间消毒器使用、维护与校准操作程序61-64SOPJ8-27台式高速冷冻离心机使用、维护与校准操作程序65-66SOP18-28高压蒸汽灭菌器使用、维护与校准标准操作程序67-68SOP_18-29超净工作台使用、维护与校准标准操作程序69-69S0P

4、_18-30旋涡振荡器使用与维护标准操作程序70-70SOP_18-31冰箱使用、维护与校准操作程序71-72SOP18-32天隆GeneRolex96全自动核酸提取仪使用、维护与校准程序73-74S0P_18-33MA-6000基因扩增检测仪使用、维护、校准程序75-81SOP8-34优思达UC0102核酸扩增检测分析仪使用、维护、校准程序82-84第三部分项目类SOPS0P_18-35临床标本的处理（核酸纯化）程序85-86SOP_18-36新型冠状病毒2019-nCoV基因（达安红盒）扩增检测操作规程87-92SOP8-37新型冠状病毒2019-nCoV基因（金豪）扩增检测操作规程93-

5、97S0P_18-38新型冠状病毒2019-nCoV基因（之江）扩增检测操作规程98-103S0P_18-39优思达新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测操作程序104-106SOP_18-40新型冠状病毒2019-nCoV基因（中元）扩增检测操作规程107-111文件审批者:发布日期：年月日第三部分项目类SOPS0P_18-35临床标本的处理（核酸纯化）程序1 .目的保证标本处理标准化、规范化，使不规范操作因素对实验结果造成的影响减至最小。2 .范围新冠病毒核酸提取。3 .职责新冠病毒标本检测项目的工作人员按此文件操作执行。4 .工作流程4. 1接收样本在接收样本前，检测人员需要按照三级

6、防护标准穿戴好，穿着防护衣、护目镜、隔离衣,并戴上N95口罩、双层手套，穿上靴套等。然后用75%的乙醇对实验室内的生物安全柜的空间和台面以及核酸提取仪等进行消毒，还需对标本转运箱进行消毒，并核对被检样本姓名、性别、年龄、编号及检测项目等，待确认转运箱完好后将其放入生物安全柜。5. 2病毒灭活已经使用含胭盐的灭活型标本采样管的实验室，这一环节无需进行灭活处理，直接进行核酸提取，而使用非灭活型标本采样管的实验室，则有56孵育3（）分钟热灭活的处理方式，病毒灭活后为避免开盖后气溶胶污染实验室和检测人员，常温静置15分钟以上再执行下一步操作。6. 3核酸提取1）标本操作人员穿戴三级防护用品，在生物安全

7、柜内将离心管依次编号。2）取出病毒提取试剂，对应标本编号。3）用旋涡混匀器对标本进行混匀，把可能含有病毒核酸的细胞从拭子标本中洗脱下来。4）在生物安全柜当中，一人开盖，一人加样，用移液器加混悬液200uL标本到提取液当中。5）裂解10分钟。6）把裂解好的核酸提取盒放入半自动核酸提取仪当中，按预先设置好的程序提取核酸。7）核酸提取完成后在生物安全柜内，将提取的核酸加至PCR扩增反应体系。4.4核酸分析，等待结果在生物安全柜内，将提取的核酸加至PCR扩增反应体系，然后将构建好的扩增体系放入扩增仪，进行核酸扩增后分析。4. 5消毒，废物处理一系列步骤完成后，需要对实验废物进行处理，并对实验仪器、桌面

8、、地面进行消毒。待检测结果出来后，对检测到的阳性、可疑阳性样本按S0P8-20新型冠状病毒核酸检测结果分析与报告管理制度、S0P8-21新型冠状病毒核酸检测疑似阳性结果、可疑结果处置应急预案进行处置。5相关记录5. 1YCXZYY/JYK-JL-SOP18-35-01附表21PCR实验室流程图S0P_18-36新型冠状病毒2019-nCoV基因（达安红盒）扩增检测操作规程1 .名称新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）2 .目的规范新型冠状病毒（2019-nCoV）RA荧光定性PCR项目检测试验，确保检测结果的准确性和重复性。3 .方法TaqMan探针实时荧光定性。4 .

9、检测原理基于一步法RTiCR技术，选取2019新型冠状病毒（2019-nCoV）ORFlab和N基因作为扩增靶区域，设计特异性引物及荧光探针（N基因探针采用FAM标记，ORFlab探针采用V1C标记）用于标本中2019新型冠状病毒RNA的检测；同时包括内源性内标检测系统（内标基因探针采用Cy5标记），用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控，可减少假阴性结果的出现。5 .样品咽拭子、痰液等6 .试剂中山大学达安基因股份有限公司组分名称规格数量主要成分PCR检测试剂（大包装，96人份/盒）2019-nCoVPCR反应液A918MLd2特异性引物、探针、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液201

10、9-nCoVPCR反应液B204L管2热启动Taq抗体酶、Taq酶、C-MMLV酶、dNTPs、UDG酶、RNasin2019-nCoV阴性质控品450L管2含2019-nCoV内标片段（RNaseP基因）的假病毒、TENC（ORFlabN）阳性质控品400ul管2含2019-nCoV目的片段的假病毒、含2019-nCoV内标片段（RNaseP基因）的假病毒、TE7.仪器苏州雅睿生物技术有限公司MA-6000实时荧光定量PCR仪。8.操作步骤8.1PCR试剂准备（I区）8.1.1从试剂盒中取出2019-nCoVPCR反应液A、2019-nCoVPCR反应液B,室温融化后振荡混匀，掌上离心机离心

11、10秒后使用。8.1.2取N个（N=待测样本个数+NC（0RFlabN）阴性质控品+NC（0RFlabN）阳性质控品）PCR反应管将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将20ul扩增体系分装到PCR管中。将装有PCR反应液的PCR管置I区区传递窗。NC单人份扩增体系配制如下表:2019-nCoVPCR反应液A2019-nCoVPCR反应液B扩增体系17ul3ul20ul8.1.3试剂准备区清洁:每次完成配液操作后，用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mgL含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。8. 2核酸模板提取（H区）核酸提取:取200

12、ul液态样本进行核酸提取。采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取或纯化试剂盒；具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。9. 3加样（II区）在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测标本核酸、阳性质控品、弱阳性质控品各5ul,盖紧管盖，6,000rpm离心数秒后，置H区I区传递窗。标本制备区清洁：每次完成试验操作后，医疗垃圾用2000mgL含氯消毒剂喷洒至完全湿润，用鹅颈式封扎，带出二区高压处理后按规范处置。用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mgL含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。10. PCR扩增检测（HI区）8 .4.1将PCR反应管放入荧

13、光PCR扩增仪进行扩增检测。9 .4.2循环参数设定：序号步骤温度时间循环数1反转录反应50oC2分钟循环1次2预变性95oC2分钟循环1次3变性955秒循环10次退火、延伸6035秒4变性955秒循环32次退火、延伸及检测荧光60oC35秒8.4.3样品设置在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型。10 结果分析选择定性分析模式，自动调整阈值，必要时可手工设定，以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值不出现任何数值为准，也可根据仪器的实际情况进行调整。11 .质控标准10. 12019-nCoV阴性质控品:FAM和VIC检测通道无Ct值或无明显扩增曲线,Cy5通道Ct25510.2 2019-nCoV阳性质控品：FAM和VIC检测通道Ct值W22；10.3 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。10.4 每批上样检测应当在剩余加样孔中设置1个弱阳性质控样本和三个阴性质控样本（2份生理盐水和1份阴性混合样本）。3份阴性质控样本随机放在临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性，3个阴性质控全部测定为阴性，视为在控。反之，则为失控，不可发出报告，应分析原因，必要时重新检测样本。1L结果判断FAM通道（green）N基因VIC通道(yellow)ORFlab基因Cy5