中药材黄曲霉素检测技术概述.docx

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1、中药材黄曲霉素检测技术概述一、中药材质量安全现状中药材是中医防病治病的重要基础。中药材在田间生长、采收加工、储藏运输等各个环节都会因污染霉菌而发生霉变。这些霉菌分泌的有毒代谢产物使中药材发霉变质，直接威胁到群众的用药安全。中药中的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素，赭曲霉素，玉米赤霉烯酮，展青毒素，伏马毒素等。中药材的种类是影响真菌毒素污染的主要因素,易污染的中药材,在不同的温、湿度条件下均可产生真菌毒素。温度和湿度条件也可以影响真菌毒素的增长,如：黄曲霉毒素在不同的温、湿度条件下均可以产生；赭曲霉毒素需要在湿度较高的条件下才能产生。近年来,随着中药材在国际市场上的持续升温,其安全性越来越引起人们的关注

2、。真菌毒素残留作为中药材微量外源性有毒有害物质,一般不表现出急性毒性,但通常有较强的蓄积性,致癌、致畸、致突变作用明显,严重影响中药材的安全性。二、中药材真菌毒素控制相关国家法规近年来，各级食品药品监管部门不断加大中药监管力度，努力保持中药质量总体稳定。国家食品药品监督管理局关于规范中药生产经营秩序严厉查处违法违规行为的通知（国食药监安2012187号文件）中，要求加强对黄曲霉毒素、重金属及有害元素、农药残留量等安全性指标的检测和控制，切实保证中药材质量和安全，另要求企业具备与生产品种相适应的检验设备和能力，严把质量检验关。国家药品安全“十二五”规划，规划中明确指出“开展药品快速检验技术研究，

3、搭建检验技术共享平台”、“加快推进药品快速检验技术在基层的应用，配置快速检验设备”，“加强县级机构快速检验能力建设”的要求。三、中药材真菌毒素检测项目及限量标准国家食品药品监督管理局对柏子仁、莲子、使君子、槟榔、麦芽、肉豆蔻、决明子、远志、慧松仁、大枣、地龙、娱蚣、水蛭、全蝎等14味药材及其饮片品种项下增加“黄曲霉毒素”检查项目，限度为“黄曲霉毒素B1不得过5gkg;黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2总量不得过IOgkg2010版药典附录IXV黄曲霉毒素测定采用高效液相色谱法，另外增补药典描述该法检测建立增加柱后光化学衍生法。四、中药材黄曲霉素检测方案介绍（一）仪器分析法特点优点缺

4、点准确、灵敏、抗干扰性强，国家检测部门的确证方法。仪器成本高、对操作人员技术要求高、操作复杂、耗时较长。免疫亲和柱-高效液相色谱法：符合2010版药典附录IXV中黄曲霉毒素测定高效液相色谱法，另外增补药典描述该法检测建立增加柱后光化学衍生法。1 .设备和耗材配置序号品名坂格及密政数矍用途1高效液相色遢权-分析检制2灵光粉潴器-f读取英光信号3Xia毒素专用色酒枝15Q250mm货号.PRC-18一支配套告爽色诣仪.M苗蠹素d费用4GuanyiBto&，!74;清曲圆毒雷总量免疫案和柱3m1.25支片.快i1过柱型.货号，IAC-O11-3肝高将异性,纯化棒本5GUanyiBto®KR

5、C光化学驻后衍生反应装置贷号，E（H（RC-H适用于看曲星事素检刷6高it均质然达到2200OrPm以上.货当EdWRI1-耐蹒性,高强,均质7GUanyiBtot®如纤雄蹴IOOPrI1Omm.15pm货号，GMF11OTt富SS毒素专用近该8GUanyiBto174;八位泵颓作架贷小EQPUMP8一台用于拄制免疫亲加枝过枝漆逋9E曲毒第疆标2卬曲雾最素B1.G1.05叩黄曲圆盘第82,G2（”4/1施于乙精.货号，STDt1OS1Im1用于定量分析标准品的配制2 .样品前处理:冠一为中药材提供不同的处理方案（详细方案请联系冠一，冠一开发了针对多种中药材基质提供优化的处理方案）3

6、.免疫亲和柱净化：富集-洗涤-洗脱-收集全部洗脱液供化学衍生检测用。4 .化学衍生为什么使用光化学衍生器？由于黄曲霉具有较强的紫外吸收和产生荧光的特性，因此可以进行HP1C紫外或荧光检测，但是同时黄曲霉毒素中的B1、G1由于其在含水的流动相中容易产生荧光淬灭,因此在很多的实验中都会采用衍生法测定黄曲霉毒素。衍生的方法也很多：有柱前的，柱后的，在线的，由于在线的柱后光化学衍生有明显的优势，所以现在被增补为药典的检测方法，优势主要在于无需任何化学试剂、对人员无伤害；无需人员直接操作、避免误差；无需担心衍生液腐蚀检测器。5 .高效液相色谱分析逐一KRC光化学徘生器被长，2MmHP1C-色格柱，黄曲&

7、基需专用U1efeiB及150x46mm,流动相，甲Sr水4555fi1e:/C:/Users/ADMINI1AppData1oca1Tempksoht1496wp52.pngB:谈样体积，201荧播网沸人喜友浓长，365nmh发射源长，455nmHPtCfiS1总效液相色语仅带有荧播洌2S，的曲霞毒It专用色语柱C18160X4.6mm（二）醐联免疫法特点优点缺点灵融度高、耗时较短、程本处理比较面单对技术人员要求不;8、检消成本长、可ISI时依洞大批量样本适用于大样本快速定量寿查.可能存在一定假阳性窣（交叉反应窣）.冠一搐出的GuanyeOm苗曲&毒索总量或剂盒具百较高的灵眼度和准他.急用于

8、大的定分析1 .方法原理采用直接竞争醐联免疫法，在微孔板上预包被黄曲霉毒素抗原，加入样本（或黄曲霉毒素标准品溶液）及辣根过氧化物酣标记的黄曲霉毒素特异抗体。样本或标准品溶液中的抗原与预包被在板孔上的抗原竞争结合醐标抗体。未结合的酸标抗体在洗涤时被除去。再加入TMB显色液，读取吸光值。样品吸光值与其所含黄曲霉毒素总量成负相关，与标准曲线比较即可得出样品中黄曲霉毒素总量的含量。2 .设备和试剂配置：品名规格及参数数量用途1GUdnyiBioR菌曲霉毒素息量试剂盒96T,灵散度，O1ppb货号，EKT-O11一盒定量分析检洌2GuanyIBIo高心，J噌25T一盒净化样本3的标仪(8关免疫检测仪)谑

9、光片，450m一台配套各类色谱仪.稼JS毒素检测用3 .样本前处理：中药材：粉碎、提取、离心，取上清液加入GUanyiBiO离心小柱进行净化。为什么要用GUanyiBi。离心小柱？中药材的基质复杂，提取时样木液颜色较深，而且不容易去除。有机试剂提取净化方法繁琐，试剂挥发对环境及人体造成危害，且净化效果不稳定。用GUanyiBi。离心小柱，则只需提取液离心过柱，即可去除提取液中的杂质，方便快捷，净化效果好，且同收率可以达到85%以上。4 .检测步骤4.1 免疫反应30min；洗板5次；显色反应30min；终止反应，酸标仪读OD值。5 .分析结果的表述用醯标仪判读结果。()免疫金标快速检测法特点操

10、作徜单、费用低廉、耗时短、检洌快速.适用于样本快遑定性初步缔查存在一定假阳性、敌据不方便保存及分析.冠一推出的GuanyiBioTM黄曲霉毒素总量免疫金标快速检测条特异性好，适用于检测样本量大；短时间出具检测结果并控制经费的情况，可以快速定性，初筛。1.方法原理黄曲霉毒素总量快速检测条应用了竞争抑制免疫层析的原理,样本中的黄曲霉毒素总量在醐标孔中与胶体金标记的特异性抗黄曲霉毒素单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上AF-BSA偶联物的结合。如果样本中黄曲霉素总含量大于05ug1,检测线不显颜色，结果为阳性；反之，检测线显红色，结果为阴性。2 .设备和试剂配置在号品名燎格及参数敛Ir用途25

11、T1GUanyiBtoTM音曲*国柔总量免疫金标快速检测条检测网，IOwb一盒定性分析检判货号，PR-O113 .分析步骤：中药材粉碎溶解后取上清液检测。吸取样品滴加到加样孔中，8-15分钟读取结果。在C线显色的情况下：T线显色比C线深或一样深是阴性。T线显色比C线浅，或无显色是阳性结果。五、温馨TIPS：1 .中药中真菌生长繁殖的有利条件主要是适宜的温度与水分。如能将中药贮存于I(TC以下，水分保持在10%以下，就能有效地防霉。2 .从事真菌毒素科研及检测的人员，必须注意防护，如穿戴隔离衣帽，在进行真菌分离培养工作时，应戴口罩，并尽量防止袍子飞扬。3 .操作台面如有漏溅，应立即用新配的5%次氯酸钠消毒。以5%次氯酸钠(NaOCI)处理时，黄曲霉毒素于数秒钟内即被破坏，故是常用的消毒剂。4 .也有应用生物学方法解毒的报道，生物学方法成本低，收效大，可能是一种有前途的除毒措施。鉴于霉菌毒素对人体的危害,提醒各位奋斗在抗毒一线的老师们一定要注意保护自身安全哦!