无菌检查方法（薄膜过滤法）中常见问题.docx

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1、无菌检查方法（薄膜过滤法）中常见问题按照2020年版中华人民共和国药典规定，只要供试品性状允许，包括能直接过滤或者 经过处理后能过滤的供试品，应采用薄膜过滤法进行无菌检查。采用薄膜过滤法，可将药物 抗菌成分去除，细菌等其他微生物则会遗留在过滤器，对其培养促使生长和繁殖，以此定性 或定量检测微生物。1常见问题及分析1.1 供试品溶解不彻底固体注射剂（如密封瓶粉针剂）无菌检查时需要溶解、转移、稀释后再采用薄膜过滤法过渡， 在溶解稀释的过程中，溶剂和稀释液的种类、比例和振荡器的使用等因素都会直接影响到供 试品的溶解过滤效果。2020年版中国药典四部无菌检查法中收载的稀释液有0.1%无菌蛋 白陈水溶液

2、、pH7.0无菌氯化钠-蛋白腺缓冲液、0.9%的无菌氯化钠溶液，试验研究结果 表明，用前两种溶液做稀释剂，其微生物的回收率远高于09%的无菌氯化钠溶液。如果供 试品溶解不彻底，过滤时滤膜会吸附大量供试品，被滤膜吸附的供试品虽经反复冲洗仍不能 去除干净，残留在滤膜上的供试品会导致阳性菌不能在规定的条件下生长。1.2 集菌培养器选择不当为了避免操作过程带来的人为污染和人为偏差，大部分实验室会优先选择用一次性全封闭集 菌培养器对供试品溶液进行过滤。全封闭集菌培养器的滤膜材质、孔径及其与检品的相容性 是影响试验结果的关键因素。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分截 留效果，即部分注射剂

3、具有抑菌性，在过滤时易被滤膜吸附，须采用疏水性边缘及低吸附的 滤膜，如可选用尼龙膜材质的集菌器。无菌检查用的薄膜过滤器的淀膜孔径应不大于0.45 m,该孔径流膜能有效截留微生物。每片淀膜的总过滤量不宜过大，以避免淀膜上的微生 物受损。目前市面上销售的一次性全封闭集菌培养器的品牌、型号、规格众多，适用的产品类型也不 相同。如某企业生产的集菌培养器：安甑瓶装药液可选用加长型取样针，无需将样品额外转 移，可快速转移检品；西林瓶装粉剂可选用双针座设计，提供全封闭溶解方案，实现溶解、 过滤、冲洗一体化操作，避免转移操作；需稀释的西林瓶装抑菌性粉剂可选用三针座设计， 溶解、稀释、过滤、冲洗一体化操作，降低

4、抑菌成分浓度，减少吸附。检验人员在选择集菌 培养器时，要结合产品溶解度、抑菌程度等以达到预期的过渡效果，选择不当会增加冲洗液 的用量并影响检验结果的可靠性。1.3 冲洗方法不具体注射剂中有的品种抑菌作用较强,供试液过滤后还需要通过冲洗液冲洗才能消除其抑菌作用。 一些无菌方法验证报告中试验操作过程过于简单，只是列出冲洗量和冲洗次数，冲洗量得出 的过程并没有详细记录，也没有注明冲洗时的流速，流速过快或过慢都会对实验结果造成一 定的影响，如过慢的冲洗流速不能把抑菌成分冲洗干净，消除不了供试品的抑菌作用，而过 快的冲洗流速会损伤微生物，从而导致检验结果不能反映供试品真实的无菌状态。1.4 培养基储存不

5、当对于适用性检查合格的培养基,储存不当会导致质量降低甚至不合格,影响无菌试验的结果。 如无菌检查中最常用的硫乙醇酸盐流体培养基，可以在普通有氧环境下提供厌氧条件，使需 氧菌和厌氧菌都能够生长良好，并易于观察结果。2020年版中华人民共和国药典四部 规定，在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/3,培养结束后，培 养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/2。对培养基有要求，是为了确保培养基的厌氧 层能够满足厌氧菌生长条件的需要。培养基氧化层的高度多少，取决于培养基的储存条件。 不同的实验室对配制好的无菌检查用培养基会有不同的储存方式，如有的实验室用量较大, 大批量配制后采用无菌

6、灌装并在容器内填充氮气，压盖，225 储存；有的实验室用量不 大，可用硅胶塞及纱布包裹瓶口灭菌后，28 避光保存。无论采用什么条件储存，都应 该进行相关的验证，以确定合理的保存条件，保证培养基的质量符合要求。1.5 酶的活性降低在抗生素类注射剂无菌检查中，除了采用薄膜过滤法消除其抑菌作用外，针对一些抗菌作用 比较强的-内酰胺类抗生素类注射剂，还可以加入中和剂-内酰胺醐，两种方法联合 使用可有效消除供试品的抑菌活性。供试品过滤、冲洗完成后，在加入培养基的集菌器中加 入中和剂3-内酰胺酶，使通过冲洗不能完全冲洗干净、吸附于滤膜的少量供试品失去活 性。3-内酰胺酸的使用，可以减少冲洗液的冲洗总量和冲

7、洗次数，避免滤膜上的微生物受 损坏。B-内酰胺醐的储存条件为28 C,储存温度的不同，酶的活力也会受到不同影响。 实验室在使用此类醐的过程中，要严格按照产品的要求储存，注意储存温度和储存时间对酶 活性的影响。储存不当，酸的活性降低，若始终按标示的能活性计算加入的量，加入的酣无 法彻底消除供试品的抗菌作用。1.6 阳性对照菌未按要求加入规定量2020年版中国药典规定应根据供试品的特性选择阳性对照菌，阳性对照实验的菌液制备同 方法适用性实验，加菌量不大于IoOCfu。有的厂家为了节约成本，检验人员用新鲜液体培 养基制备好菌液，检测一次菌液的含菌量，符合要求后就储藏于4 冰箱多次使用，而在 后面的使用中均按第一次的使用量加入，并没有每次使用时都检测所加入菌液量是否在规定 范围内，导致企业在进行验证时实际加入的阳性对照菌量多于规定量甚至是规定量的几倍, 阳性菌在规定培养条件下生长良好，出现了实验成立的假象。