LabAlliace高效液相色谱系统培训教材.docx

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1、LabAlliace高效液相色谱系统培训教材一、液相色谱系统的基本原理1、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)与液相色谱法(LC)。 气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不一致又可分 为气固色谱法(GSC)与气液色谱法(GLC),其中以GLC应用最广。液 相色谱法适用于分离低挥发性或者非挥发性、热稳固性差的物质。LC 同样可分为液固色谱法(LSC)与液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流 体色谱法(SFC),它以超临界流体(界于气体与液体之间的一种物相) 为流淌相(常用CO2),因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析 时间短，特别适用于手性化合物的拆分。按原理分为吸

2、附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法 (IEC)排阻色谱法(EC,又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色 谱法(GPC)与亲与色谱法。(此外还有电泳)。按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。2、液相色谱理论进展简况色谱法的分离原理是：溶于流淌相(mobile PhaSe)中的各组分通过 固定相时，由于与固定相(StationaryPhaSe)发生作用(吸附、分配、离 子吸引、排阻、亲与)的大小、强弱不一致，在固定相中滞留时间不 一致，从而先后从固定相中流出。又称之色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳

3、酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(ChrOmatOgraPhy)因之得名。 后来在此基础上进展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色 谱法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温与常压下用 液位差输送流淌相，称之经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长(常 有几个小时)。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography, HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代 后期引入了气相色谱理论而迅速进展起来的。它与经典液相色谱法的 区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需 用高压输送流淌相，故又称高压液相色谱法(High P

4、ressure Liquid Chromatography, HPLC)o又因分析速度快而称之高速液相色谱法 (High Speed Liquid Chromatography, HSLP)。也称现代液相色谱。3、HPLC的特点与优点HPLC有下列特点：高压一压力可达150300kg/Cm2。色谱柱每米降压为75 kgcm2 以上。高速一流速为。.1100.。mlmio高效一可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100 种。高灵敏度一紫外检测器灵敏度可达0.01ngo同时消耗样品少。HPLC与经典液相色谱相比有下列优点：速度快一通常分析一个样品在15-30 min,有些样品甚至在5

5、min 内即可完成。分辨率高一可选择固定相与流淌相以达到最佳分离效果。灵敏度高一紫外检测器可达0.01ng,荧光与电化学检测器可达O-Ipgo柱子可反复使用一用一根色谱柱可分离不一致的化合物。样品量少，容易回收一样品通过色谱柱后不被破坏，能够收集单 一组分或者做制备。4、高效液相色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不一致分为液固吸附色谱法、液液 分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子 排阻色谱法。a液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离 原理是根据固定相对组分吸附力大小不一致而分离。分离过程是一个 吸附一解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或者氧化铝，粒度

6、510m0适用于分离分子量2001000的组分，大多数用于非离子型 化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。b.液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或者化 学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在 流淌相与固定相中溶解度不一致而分离。分离过程是一个分配平衡过 程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流淌相务必预先用固定相饱 与，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化与不一致批号流淌相 的区别常引起柱子的变化；另外在流淌相中存在的固定相也使样品的 分离与收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已 很少使用。现在多使用的是化学键合固定相，如Cl8、C

7、8、氨基柱、 氧基柱与苯基柱。液液色谱法按固定相与流淌相的极性不一致可分为正相色谱法 （NPC）与反相色谱法（RPC） o正相色谱法使用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与月青基键合 相）；流淌相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烧类如正己烷、环己烷）, 常加入乙醇、异丙醇、四氢吠喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。 常用于分离中等极性与极性较强的化合物（如酚类、胺类、携基类及 氨基酸类等）。反相色谱法 通常用非极性固定相（如Cl8、C8）;流淌相为水或 者缓冲液，常加入甲醇、乙月青、异丙醇、丙酮、四氢吠喃等与水互溶 的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性与极性较弱的化合 物。RPC在现代液相色谱中应

8、用最为广泛，据统计，它占整个HPLC 应用的80%左右。随着柱填料的快速进展，反相色谱法的应用范围逐步扩大，现已 应用于某些无机样品或者易解离样品的分析。为操纵样品在分析过程 的解离，常用缓冲液操纵流淌相的PH值。但需要注意的是，C18与 C8使用的PH值通常为2.57.5 （28）,太高的PH值会使硅胶溶解， 太低的PH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在PH 1.5-10 范围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高中中低流淌相极性低中中高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明 显的界线（如氨基键合固定相）

9、。C.离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二 乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上较基、磺酸基（称 阳离子交换树脂）或者季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色 谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流淌相中具有相同电荷的离 子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有 不一致的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流淌相。被分离组分在离子交换柱 中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关 外，它还受流淌相的PH值与离子强度影响。PH值可改变化合物的 解离程度，继而影响其与固定相的作用。流淌相的盐浓度大，则离子 强度高，不利于样品的解离，

10、导致样品较快流出。离子交换色谱法要紧用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。d.离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。 它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物 后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。要紧用 于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、 辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强 的离子对。分析酸性物质常用四丁基季镂盐，如四丁基溟化镂、四丁基镀磷 酸盐。离子对色谱法常用ODS柱（即C18）,流淌相为甲醇-水或者乙 月青-水，水中加入310 mol/L的离子对试剂，在一定的PH值范

11、围内 进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流淌相构成及其 PH值、离子强度有关。e.排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料，流淌相是 能够溶解样品的溶剂。小分子量的化合物能够进入孔中，滞留时间长; 大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流淌相流出。它利用分子筛 对分子量大小不一致的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分 离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。5、固定相与流淌相在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是 色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立与优 化的任务之一。本节着重讨论填料基质、化学键合固定相与流淌相的 性质及其选择。

12、（1）基质（担体）HPLC填料能够是陶瓷性质的无机物基质，也能够是有机聚合物 基质。无机物基质要紧是硅胶与氧化铝。无机物基质刚性大，在溶剂 中不容易膨胀。有机聚合物基质要紧有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲 基丙烯酸酯。有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或者溶质容易渗 入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。A基质的种类1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。除具有高强度外，还提供一 个表面，能够通过成熟的硅烷化技术键合上各类配基，制成反相、离 子交换、疏水作用、亲水作用或者分子排阻色谱用填料。硅胶基质填 料适用于广泛的极性与非极性溶剂。缺点是在碱性水溶性流淌相中不 稳固。通

13、常，硅胶基质的填料推荐的常规分析PH范围为28。硅胶的要紧性能参数有：平均粒度及其分布。平均孔径及其分布。与比表面积成反比。比表面积。在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质 的k值越大。含碳量及表面覆盖度（率）。在反相色谱法中，含碳量越大， 溶质的k值越大。含水量及表面活性。在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小, 其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。端基封尾。在反相色谱法中，要紧影响碱性化合物的峰形。几何形状。硅胶可分为无定形全多孔硅胶与球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。硅胶纯度。对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱 性成份不拖

14、尾。2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的PH范围。它也 是刚性的，不可能在溶剂中收缩或者膨胀。但与硅胶不一致的是，氧 化铝键合相在水性流淌相中不稳固。只是现在已经出现了在水相中稳 固的氧化铝键合相，并显示出优秀的PH稳固性。3）聚合物以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或者聚甲基丙烯酸酯为基质的填 料是用于普通压力下的HPLC,它们的压力限度比无机填料低。苯乙 烯-二乙烯苯基质疏水性强o使用任何流淌相，在整个PH范围内稳固, 能够用NaOH或者强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯 乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但它能够通过适当的功能基修饰变成亲 水性的。这种基质不如苯乙烯-二乙烯苯

15、那样耐酸碱，但也能够承受 在pH13下反复冲洗。所有聚合物基质在流淌相发生变化时都会出现膨胀或者收缩。用 于HPLC的高交联度聚合物填料，其膨胀与收缩要有限制。溶剂或者 小分子容易渗入聚合物基质中，由于小分子在聚合物基质中的传质比 在陶瓷性基质中慢，因此造成小分子在这种基质中柱效低。关于大分 子像蛋白质或者合成的高聚物，聚合物基质的效能比得上陶瓷性基质。因此，聚合物基质广泛用于分离大分子物质。B.基质的选择硅胶基质的填料被用于大部分的HPLC分析，特别是小分子量的 被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物质，要紧用来制成分 子排阻与离子交换柱。硅胶氧化铝苯乙烯-二乙烯苯甲基丙烯酸酯耐有机溶剂+适用PH范围+抗膨胀/收缩+耐压+表面化学性质+效能+注：+好 +通常 +差(2)化学键合固定相将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上 而形成的固定相称之化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲 洗，同时能够通过改变键合相有机官能团的类型来改变分离的选择 性。A.键合相的性质目前，化学键合相广泛使用微粒多孔硅胶为基体，用烷烽二甲基 氯硅烷或者烷氧基硅烷与硅胶表面的