二代测序技术在原发灶不明肿瘤诊疗中的研究进展2023.docx

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1、二代测序技术在原发灶不明肿瘤诊疗中的研究进展2023摘要原发灶不明肿瘤(Cancerofunknown primary , CUP )是一类罕见且预 后不良的恶性肿瘤,分析和寻找原发灶、组织类型或分子免疫特征对改善 患者的预后具有重要意义。在精准医疗背景下，二代测序 (next-generation sequencing , NGS )可以利用肿瘤组织或外周血标 本从基因层面对这类患者进行检测以指导诊断与治疗，延长患者生存期， 改善预后。本文针对NGS样本的选择、NGS指导下的CUP患者的组织 溯源、分子特征、指导治疗等方面进行综述。前言原发灶不明肿瘤(Cancerofunknown prim

2、ary , CUP )是一类相对罕见 的肿瘤，即在体内发现了恶性肿瘤细胞，但无法通过临床、影像、病理及 实验室指标等全面检查从解剖学上确定原发灶部位的转移性肿瘤。大多数 CUP患者由于原发灶不明确，通常只能接受含钳/紫杉类的经验性化疗， 预后较差，生存期较短，中位总生存期1年1-3,所以积极寻找原发部 位、研究组织类型或分子免疫特征对改善患者的预后具有重要意义。第二 代测序(next-generation sequencing , NGS )也称高通量测序,是目 前最常用的基因检测手段之一，可以在较短时间内检测出肿瘤患者的基因 变异情况，辅助指导临床诊疗。欧洲肿瘤内科学会(ESMO )、国家综

3、合 癌症网络(NCCN )及中国抗癌协会都发布了关于在CUP患者中使用NGS 的建议，NGS可以帮助50.9%的CUP患者找到原发灶4,并可检测出具 有临床指导意义的基因改变5,包括靶向治疗靶点和免疫治疗生物标记 物。本文针对NGS样本的选择、NGS指导下的CUP患者的组织溯源、 分子特征、指导治疗等方面进行综述。01、NGS样本的选择对于适合NGS检测分析样本的选择，临床中首选新鲜肿瘤组织标本，也 可选择福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织、肿瘤细胞学样本及血浆等。未 接受过靶向/免疫药物治疗的患者，NGS检测应首选经病理评估的组织样 本，优先使用手术切除样本,也可选择活检样本,再次检测可选择液体

4、活 检样本进行动态监测；接受过靶向/免疫药物治疗的患者，应尽可能使用治 疗后的样本,进而寻找治疗后新出现的耐药突变。基于手术切除或穿刺活 检的肿瘤组织是CUP分子检测的主要样本，当转移性肿瘤组织样本难以 获取或组织样本质控不合格时，体液样本，尤其是外周血循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA , CtDNA )则是研究CUP起源和分子特征的 一种可行方法。与组织学检测相比，外周血CtDNA检测具有无创或微创、 可反复取材等优势6,但受正常细胞胚系变异或克隆性造血细胞体系突变 干扰，也会导致假阳性结果7-8,假阳性率02、NGS在CUP诊疗中的意义2.1 组织溯源，明确诊断基

5、因表达谱可在分子水平揭示肿瘤的组织起源，通过对比分析待测肿瘤组 织样本与已知来源肿瘤分子层面的相似性，可以鉴别其肿瘤类型，寻找原 发灶。日本研究团队的一项前瞻性、多中心、非随机的临床II期研究10 招募了 111例CUP患者,基于NGS的RNA和DNA图谱分析预测出15 个肿瘤原发部位，其中最常见的是肺癌（21.6% ）、肝癌（15.5% ）、肾 癌（15.5% ）、结直肠癌（12.4% ）,这与既往尸检分析的结果类似口 10 SChiPPer等12基于全基因组测序设计了一种预测算法,在CUP队列中, 最常见的原发肿瘤略有不同，分别为非小细胞肺癌、胃食管癌、胰腺癌和 结直肠癌。M。等13报道了

6、 1例原发灶不明同时伴乳腺、肺、胃和卵巢多发性肿瘤 的患者，在乳腺和肺肿瘤组织中使用NGS检测到伴有棘皮动物微管结合 蛋白样与间变性淋巴瘤激酶融合基因（echinoderm microtubule-associated protein- like 4-anaplastic lymphoma kinase , EML4-ALK）重排，该基因改变在非小细胞肺癌中较常见，综合 免疫组织化学及NGS结果考虑原发灶为肺。Yu等14报道了 1例胸骨后 恶性占位性病变的患者，影像学均无法确定原发部位，通过NGS检测到 人表皮生长因子受体 2 （receptor tyrosine-protein kinase

7、 2 , ERBB2 ） 扩增，协助临床找到原发灶为乳腺。本中心也报道了1例影像学和常规组 织病理学无法确诊，经NGS测序明确诊断的罕见胰腺癌结肠转移的案例15o综上所述，NGS的组织溯源作用主要表现在以下几个方面：1 )当 影像及组织病理学同时发现多处肿瘤病灶，无法明确原发病灶时；2 )当 影像及组织病理学只发现一处病灶，无法明确原发病灶时；3 )当患者在 肿瘤病史(包括单原发或多原发)基础上出现新的病灶，无法明确为转移 还是继发时。2.2 揭示分子特征，指导个体化治疗2.2.1 基于基因变异的靶向治疗NGS技术对一定数量的癌症相关基因编码区进行大规模基因组测序来分 析存在的基因组改变以指导

8、临床治疗，这些基因组改变包括突变、基因重 组、DNA插入/缺失、拷贝数变化等。Re)SS等16对200例CUP组织标 本进行NGS检测，发现169例(85% )检测到一个或多个潜在可靶向治 疗的基因变异，在原发灶不明的腺癌中有72%的CUP患者存在临床上常 见的酪氨酸激酶信号通路上的基因变异，其中最常见的基因变异为肿瘤蛋 白p53 (tumor protein p53 , TP53 )、Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源 物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog , KRAS )、细胞周 期依赖性激酶抑制因子 2A ( cyclin-depend

9、ent kinase inhibitor 2A , CDKN2A )、髓细胞组织增生原癌基因(myelocytomatosis oncogene , MYC )、富含 AT 的相互作用域 IA 基因 AT-rich interaction domain 1A , ARID1A )、髓样细胞白血病蛋白 1 ( myeloid cell leukemia 1 , MCL1 )、 磷脂酰肌醇 3-激酶催化亚基( phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit S, PIK3CA )、ERBB2s 上皮生长因子受体(epithelial growth f

10、actor receptor, EGFR )等，这与以往报道的CUP队列相似10, 17o Varghese等18对150例CUP患者进行NGS检测，结果显示137例 (91%)至少检测到一种基因改变，45例(30% )具有靶向治疗的基因 改变，接受靶向治疗的患者治疗失败时间1 14个月不等。Jia等19对1 例CUP患者的外周血进行NGS检测，检出乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene 1 , BRCA1 ) R71K 突变,接受奥拉帕利治疗 后无进展生存期超过15个月。1例原发灶不明的转移性腺癌患者组织经 NGS 检测发现间质表皮转因子(mese

11、nchymal to epithelial transition factor, MET)扩增，服用克嗖替尼1个月后获得完全缓解，肿瘤标志物 恢复正常水平20。大多数CUP患者可通过NGS检测出至少一个基因改 变，是靶向治疗潜在的优势群体。随着泛瘤种的靶向药物逐渐获批上市，治疗不再局限于单一瘤种，这为 CUP带来了福音。目前泛癌种靶向基因主要包括神经营养因子受体酪氨酸 激酶(neurotrophin receptor tyrosine kinasez NTRK)融合、鼠类肉瘤滤 过性毒菌致癌同源体 B1 ( V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog

12、 B1 , BRAF ) V600E突变和转染重排原癌基因(rearranged during transfection proto-oncogene , RET )融合。NTRK 抑制齐J拉罗 替尼是全球首个泛瘤种的靶向药物，NTRK基因改变在CUP中的发生率 为12% ,二线接受NTRK抑制剂无进展生存期可达9个月21o Ricco等22报道了 1例原发灶不明的大细胞神经内分泌癌的患者，NGS检测出 BRAF V600E突变，化疗进展后使用达拉非尼联合曲美替尼治疗达到部分 缓解，并通过检测CfDNA中BRAF V600E的表达情况对疾病的反应进行 动态监测。RET融合常见于分化良好的甲状腺

13、癌和非小细胞肺癌，在CUP 中的发生率为0.7% 23-24o LIBRETTO-001研究纳入41例RET融合阳 性CUP患者进行疗效分析发现，总体客观缓解率为44% ,缓解持续时间 为24.5个月，其中CUP患者对塞普替尼的治疗也有客观反应25-26。综上所述,NGS检测可以帮助CUP患者找到可指导靶向治疗的基因变异, 筛选CUP靶向治疗的获益人群，临床疗效的评估仍需大样本的临床研究 进一步探索。2.2.2 基于肿瘤突变负荷、程序性细胞死亡-配体1、微卫星不稳定状态的免疫治疗肿瘤突变负荷高(tumor mutation burden high , TMB-H )、微卫星高 度不稳定(mic

14、rosatellite instability high , MSI-H )及程序性细胞死亡- 配体 1 ( programmed cell death-ligand 1 , PD-L1 )高表达已经被批准 作为评估免疫检查点抑制剂治疗效果的泛癌种生物标志物，不再考虑肿瘤 的组织来源。2017年美国临床肿瘤学会(ASCO )会议上报道了一项研究, 对6 116例CUP标本进行测序,其中10.1 %的CUP存在TMB-H ( 20 mutMb) , 1.6%的 CUP 存在 MSl-H。GataliCa 等27报道了相似的比 例。Haratani等28通过免疫组化和免疫相关基因表达谱检测确定92

15、例 CUP患者肿瘤组织中PD-L1的表达和肿瘤浸润淋巴细胞的密度，结果发 现CUP患者的免疫特征与免疫检查点抑制剂反应性实体瘤相似表明CUP 患者能从免疫治疗中获益。基于此研究，纳武利尤单抗治疗CUP疗效的 开放标签期研究结果显示29,既往接受过化疗的CUP患者的中位总生 存时间为15.9个月，且在PD-L1高表达、TMB-H及MSI-H的亚组中疗 效更好，表明纳武利尤单抗是CUP的潜在额外治疗选择。纳武利尤单抗 也因此于2021年底在日本获批用于治疗CUP0 NCCN指南推荐对于基因 检测结果为错配修复缺陷(dMMR ) /MSI-H或TMB-H ( 10 mut/Mb ) 的CUP患者，可

16、以选择帕博利珠单抗治疗。在Mei等30报道的CUP 患者中，NGS未检测出特殊靶点，但PD-L1肿瘤比例评分为80% ,TMB 16.7 mut/Mb ,在以免疫治疗为主的综合治疗后获得了 40个月以上的生 存期，CUP患者在NGS指导下的免疫治疗中显著受益。2.2.3 耐药机制分析与动态检测疗效由于肿瘤存在异质性，空间异质性会导致局部的组织活检难以准确反映肿 瘤的全貌，时间异质性会导致一次检测无法实时监测治疗过程中肿瘤演变 以及耐药。外周血NGS检测既能克服肿瘤空间异质性，可相对全面地反 映患者的肿瘤分子特征31,也可在治疗不同阶段多次送检，克服肿瘤时 间异质性。Zhao等32报道了 1例对化疗不耐受的CUP病例，胸壁、肝 脏、纵隔淋巴结病灶中用NGS均检测到EML4-ALK融合，经ALK抑制剂 克嗖替尼治疗有效，耐药后CtDNA检测显示出ALK L1196M和G1269A 耐