(分析方法开发)影响关键色谱峰对分离度的重要因素.docx
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1、、乙 、一刖色谱分离是建立HPLC方法的首要考虑因素,深刻理解实验色谱参数如何影 响分离效果,可以很好的帮助我们建立分析方法,运用HPLC技术解决研发过程 中遇到的分析问题。反相色谱方法(RPC)开发的一个重要开始起点,是选择合适的色谱条件, 为一个给定的样品提供一个可靠的分离结果。两个色谱峰的分离度通常采用它们 的保留时间和峰宽计算得到:Rs=2tR-tR(i)(Wi+Wj), Wi和 Wj代表色谱峰i和j的峰宽。色谱峰保留因子与保留时间的关系:k=(tR-tO)tO色谱峰宽、理论塔板数、保留因子的关系:W=4N-0.5t0(l+k)由上面公式,可以导出色谱峰间分离度与保留因子、选择因子和理
2、论塔板数 之间的简单关系:分离度可以划分为三项:a项(第一个峰的保留因子),b项(分离因子)和 c项(柱效或塔板数)。从这个公式中可以看出两个色谱峰之间的分离度,与峰 保留因子、选择因子和理论塔板数密切相关。通过改变这三项中的任意一项的值,都可以改善峰之间的分离度,其中提高 分离选择性(Q ),是最有力的方法。图1是等度条件下的分离度公式,下图2是梯度条件的分离度公式。图2:分离度公式(梯度)当需要分离多个色谱峰时,对于分离程度最差的一对色谱峰来说,分离度的 要求是R2.0o这一对色谱峰通常被称为关键色谱峰对。它们的分离度是方法 优化关注的焦点。方法建壬力开发时,第一步关键是选择一根柱效足够、
3、选择性较好的色谱柱, 色谱柱固定相是影响选择性最大的因素;依次是改变溶剂的强度,使色谱峰保留 因子k值落在合适的区域范围,优化选择性,最后是调整柱子的柱效塔板数, 得到最优的分离度和分析时间。图3:色谱参数对分离度的影响1 .保留因子k的优化样品的保留因子k可以通过样品的保留时间和方法的死时间计算得到, k=(tR-tO)tO死时间t可以通过色谱柱柱长近似计算,tO=O.OlL, L为色谱柱长度(单位 mm)o当选定色谱柱后,t是一个常数,因此k值的大小可以通过改变有机相的 组成(B%)来控制。通常k值控制在IWkWIO范围比较合适,如图3。图3相对分离度与k值的关系k=10时,当其它影响因素
4、不变时,k值的增加几乎不再改善分离度,只会延 长样品的保留时间。当分析方法用于制剂分析时,k2时,目标峰可以很好的 与一些没有保留的辅料干扰峰分离。RPC的保留会随着有机相比例B的改变而变化,表达为:Iogk=Logkw-S必 是B溶剂的体积(为0.01*%B) ,kw是当为。时的保留因子,S为常数, 对于分子量100-500Da的化合物来讲,Sp4。因此每增加0.1个单位(+10%B), k值相应的减少到原来的1/10,或下降2.5倍。反之,每减少0.1个单位(-10%B), k值相应的增加2.5倍。如例1: 80%的流动相B作为初始条件,0.3k0.8o当流动相B为70%时, 峰1的k=2
5、.5*0.3仁0.8,最后一个峰为0.8*2.5=2;依次降低有机相B的比例,找到 合适的k值,如c, 1.8k6.6o上述计算中的“2.5倍法测”只是一个粗略的方法,能够给出一个近似值参 考。80%甲号 (03C08)DlM (分伸)60%W,L 心尺 JV. 尺 0246时同(分A)50%甲餐(d)(4I9) I例1:分离效果和k随流动相中B的变化而变化2 .选择性Q的优化选择性与保留因子间的关系如:。=k2kl,色谱峰的选择性可以通过调节它的 相对保留来改变。色谱条件有机相B%比例、B溶剂类别、柱温、柱子类型、流 动相PH值、缓冲液离子浓度、离子对试剂浓度等对色谱的相对保留有影响。表1:
6、不同分离条件对保留因子、选择性和塔板数的影响。条件IraNRR常利(乙I甲解等)M度色访住的奥P(G一叔从等)演动相的Pr馒冲渔除废离对试制的浓值.色诚”的长度OO陀大小OO流速OO如例2: B%的改变可以使得k值落在合适的范围内,但需要进一步优化条 件。因此通过调整B%比例和柱温,使得六个色谱峰都达到了分离的要求,如d。 这个例子是改变选择性的一个简单且典型的示例,通过两因素两水平的改变,设 计四个实验,可以达到优化方法的最终要求。(a )45%B,30r时间(分仲)(H)45%B.45i:2O%B.47T4i2O4H.4.0例2:同时改变B%比例及柱温来优化分离度目前市场上有一些方法开发的
7、软件,如DryIab,ACD lab,可以进行方法开发 的实验设计,两个或三个因素,两个或三个水平的变化,得到的分析数据通过专 业软件,建立分离度与因素和水平之间的模型,预测分离度在哪个范围条件下可 以达到最优的结果。3 .色谱柱柱效优化根据上图1分离度公式,色谱柱塔板数的提高可以改善色谱峰间的分离度。 通过改变色谱柱的长度、粒径和流速,可以改善塔板数N。理论塔板数公式:N=16(tRW)2, N=(VH)Lo一般情况柱子塔板数的提高,意味着保留时间的延长。延长色谱柱、减小粒 径和降低流速都可以增加理论塔板数。延长色谱柱和减小粒径的条件改变,会提 高系统的压力,这个需要分析工作者注意。在以前的
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