填料对HILIC色谱柱性能有哪些影响？.docx

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1、填料对HILIC色谱柱性能有哪些影响？液相液相色谱柱的性能主要取决于填料的性质和类型。填料的大小、形状、键合相、含碳量 等均能影响液相色谱柱的性能，这对我们使用及选择色谱柱都是非常有帮助的。今天我们一 起看看填料是如何影响HlLlC色谱柱的性能的呢？水色谱 HILIC(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)是一种用来改善在反相色谱中 保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有 机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的，但本质上是可以使用反相流动相的正相色 谱。HllJC模式色谱柱综合了液液分配、离子交

2、换和氢键作用：极性分子首先在主体流动相 与色谱填料表面的半固定的高极性水膜之间发生液液分配;次级保留作用包括色谱填料表面 硅醇基和/或极性官能团与带电分析物发生的离子交换作用；氢键作用发生在带正电的分析 物与带负电的表面硅醇基之间。因此HlLlC模式色谱柱适用于含如下图所示官能团的物质。OHSHOH HOnplox目前HILIC技术已经越来越多的被用做HPLC方法开发策略的一部分，作为传统反相色谱技 术的补充，不仅可以保留高极性化合物，还能够提供巨大的选择性差异，获得与反相分离时 完全相反的洗脱顺序。因此，HILIC模式色谱柱广泛应用在有机酸、多巴胺、组胺、喀咤及 水溶性维生素等极性物质的分离

3、中。液相液相色谱柱的性能主要取决于填料的性质和类型。 填料的大小、形状、键合相、含碳量等均能影响液相色谱柱的性能，这对我们使用及选择色 谱柱都是非常有帮助的。色谱柱填料类型常见的液相色谱柱填料有CK C3、C4、C8、CI8、C30、氨基、氟基、硅胶色谱柱等。 常见色谱柱中的填料分类：1、反相(与离子对)方法C18 （十八烷基或ODS）：普适性好，保留性强，用途广；C8 （辛基）：与C18相似，但保留值稍小;C3, C4：保留值小，大多用于肽类与蛋白质；Cl【三甲基硅烷（TMS）L保留值最小，最不稳定；苯基，苯乙基：保留值适中，选择性有所不同；CN （鼠基）：保留值适中，正相和反相均可使用；N

4、H2 （氨基）：保留性弱，用于燃类，欠稳定；聚苯乙烯基b：在1PH IO m等。2、形状的影响液相色谱柱的填料分为无定型和球型。无定型填料制备的液相色谱柱柱床结构不均匀， 流动相线性速度不均匀，色谱图的峰形较宽；球型填料制备的液相色谱柱柱床结构均匀，因 此色谱柱柱效高、重现性好。球型填料是目前最为常见的液相色谱柱填料，这种填料具有更 好的性能和重现性。3、键合相的影响以硅胶为基质，通过化学键合的方式把CI8、C8、氨基、鼠基等基团键合在基质上, 作为液相色谱柱中的填料。通过键合不同的化学基团，得到不同性能的液相色谱柱。由于不 同键合基团的分离机理不同，从而影响化合物的保留与分离。填料的键合使得

5、液相色谱柱的固定相相对较为稳定，不易流失，同时很大程度上消除 了硅羟基的不良影响，可适用于多种流动相中，应用广泛。然而，键合后的填料耐酸性较差，PH值不能小于2,当流动相PH超出酸性范围时，键合相易流失，耐用性和稳定性会变差。4、端基封口的影响硅胶因具有特殊的表面化学特性，被广泛用作液相色谱柱填料基质材料。硅胶表面具 有硅羟基，硅羟基的密度、分布，及其化学特性对各种类型的色谱行为都会产生不同程度的 影响。在使用以硅胶为基质的高效液相色谱柱特别是在反相色谱柱时,经常会遇到因游离的硅 羟基（或称为硅醇基）而导致的非特异性吸附。对一些极性较强的溶质，如碱性物质，色谱 峰会严重拖尾，甚至会因强吸附而不

6、能洗脱。通常采用封尾的方式减少硅羟基的影响，具体 做法是将填料与小硅烷（如三甲基氯硅烷）进行后续反应，反应掉部分残余硅羟基，以增加 表面覆盖率。采用该方式不仅可以减少不可逆吸附或拖尾，还能增加碳含量。但是，该方式 并不能完全反应掉残余的硅羟基，仍有50%的硅羟基未被反应。5、含碳量的影响液相色谱柱填料，特别是反相填料的含碳量，常被用于表征表面化学修饰程度。通常 通过键合作用将碳链引入到填料中，填料含碳量越高，说明碳链密度越高，碳链越长，容量 因子越大，疏水性越强。在反相条件中，碳链增长，意味着填料具有更大的比表面积，缔合 作用增强，待测物质保留增加。因此，高含碳量填料的液相色谱柱稳定性好，重复

7、性好，有 利于保留效果差的化合物的分离，可以改善极性化合物的拖尾；低碳量填料的液相色谱柱有 利于分析中性及碱性化合物，可以降低溶剂损耗。6、其他因素的影响除上述情况外，硅胶填料的活性、杂质含量、PH稳定性、热稳定性等也会影响液相 色谱柱性能。生产硅胶时，处理温度不同，硅胶活性也不同。硅胶的活性是选择性差异的主要来源， 主要影响碱性化合物的保留行为；硅胶的杂质含量是色谱柱质量好坏的重要标志，重金属含 量低，硅羟基活性小，拖尾减小。HILIC色谱柱的使用注意事项1、HlLIC色谱柱的平衡使用50倍柱体积的50/50的乙月青/水相缓冲溶液（缓冲液的最终浓度为IOmM）平衡 新色谱柱。在开始进样前，用

8、20倍柱体积的起始流动相平衡色谱柱。进行梯度分析时，进样间隔需要用10倍柱体积起始流动相平衡色谱柱，色谱柱平衡不 充分将导致保留时间漂移。2、HlLIC流动相需要注意的问题流动相中总是至少保持5%的极性溶剂（如5%水相缓冲液，5%甲醇或3%甲醇+2%水相缓冲 液等），保证HILIC硅胶填料始终被水浸润。在流动相或梯度中至少保持有机溶剂（如乙晴）的比例不低于40%。不要使用磷酸盐缓冲溶液体系，因为磷酸盐缓冲液在HlLlC色谱模式下会析出，使用 磷酸则没有问题。甲酸镂或乙酸镂水溶液缓冲系统比甲酸或乙酸的水溶液重现性更好。如果不能使用缓 冲液而一定要使用流动相添加剂如甲酸，最好使用0.2%的浓度而非

9、0.1%。为得到最好的峰形，在流动相或梯度中总是保持缓冲系统的浓度为IOmMo3、HlLIC稀释剂需要注意的问题如果可能，尽量用100%乙月青溶解样品进样。避免使用水配制样品溶液，请选择较弱的HlLlC 溶剂，如乙晴、甲醇、异丙醇等配制样品溶液。最常用的稀释剂为75/25乙晴/甲醇，这个体系充分平衡了样品的溶解度和峰形两个因 素。不要用水或DMSO做稀释剂，它们将导致峰形变得很差。使用反相SPE技术将水或DMSo置换成乙晴再进样。如果不能这样操作，用有机溶剂 稀释水或DMSOo4、其它有关使用HILIC的建议开始时可以运行一个95%乙月青至50%乙月青的梯度，如果样品不保留，使用95/3/2的

10、乙 晴/甲醇/水相缓冲溶液的流动相进行等度分析。将流动相中的水换成甲醇、丙酮或异丙醇也可以增加极性化合物的保留o请确保洗针溶剂/冲洗溶剂包含和流动相一样的高比例有机相，否则峰形会受到影响。5、色谱柱清洗、再生和保存（1）清洗和再生。压力骤然升高，保留时间或分离度发生波动往往表明色谱柱被污染 了，可根据如下操作清洗色谱柱。用50/50的乙月青/水清洗以去除极性污染物。如果清洗无效，可用5:95的乙月青/水清洗 色谱柱。如果系统压力上升至超过设定的压力限或者突然出现色谱峰分叉，通常是需要更换保 护柱的信号。（2）色谱柱的保存。如果较长时间内不使用色谱柱，请将柱子保存在95%乙月青中。不 要将色谱柱保存在缓冲盐流动相中，如果流动相中含有缓冲盐，先用10倍柱体积的HPLC 级水清洗色谱柱然后换上95%乙月青保存。如果中间不用水“过渡”清洗有可能在使用95% 乙晴时造成盐析出。