光热治疗联合降解肿瘤细胞周围基质治疗三阴性乳腺癌的实验研究.docx

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1、光热治疗联合降解肿瘤细胞周围基质治疗三阴性乳腺癌的实验研究目的探讨降解肿瘤细胞周围基质对聚乙二醇修饰的金纳米 星(GNS PEG)肿瘤递送及三阴性乳腺癌光热治疗疗效的影 响。方法构建GNS-PEG颗粒，观察其理化特征并检测其光热性 能。在细胞水平检测常山酮(HF)和光热治疗的细胞毒性。于 BALB/c裸鼠皮下接种4T1细胞建立三阴性乳腺癌小鼠模型。 经尾静脉注射5次HF(HF组)，对肿瘤组织切片行马松染色 及转化生长因子BI(TGFB 1)、a平滑肌肌动蛋白(a SMA), CD31免疫组化染色，观察肿瘤基质降解效果。经尾 静脉注射5次HF后再注射GNS - PEG(HF+GNSPEG组)，

2、采用电感耦合等离子体质谱法测定肿瘤组织中GNS-PEG 的含量。以近红外激光照射GNS-PEG组和HF+GNS-PEG 组小鼠的肿瘤部位，用红外摄像机记录温度变化。观察各组 小鼠的肿瘤生长和体重变化情况。对各组小鼠的肿瘤组织切 片行Ki-67免疫组化染色、原位末端转移酶标记染色和HE 染色，观察肿瘤增殖、凋亡及坏死情况。对各组小鼠的心、 肝、脾、肺及肾组织切片行HE染色，观察细胞形态变化。结果成功构建了具有多枝结构的GNS-PEG颗粒，粒径为 73.5 nmo GNS的吸收峰为810 nm,处于近红外区。GNS- PEG的光热转换率高达79.3%,并且可以通过激光能量控制 光热效果。HF具有浓

3、度依赖的细胞毒性，当HF浓度达IOOO nmol/L 时，4T1 细胞存活率低至(22.82.6)% GNS-PEG 的光热作用对4T1细胞杀伤效果显著，当浓度达25 pmol/L 时，细胞存活率为(32.75.2)% HF组小鼠肿瘤组织中胶原 蛋白容积分数、TGFB 1积分光密度和 SMA积分光密度 分别为(2.1 0.2)%、3.1 0.4、5.21.9,均低于对照组(均 P0.01),血管直径为(8.62.9)m,高于对照组(PVO.05)。HF+GNSPEG组小鼠肿瘤组织中金元素浓度为52.4 gg, 高于 GNS-PEG 组(15.9 gg, Pfuginone, HF)能够从多方面

4、减 少肿瘤ECM,包括抑制I型胶原蛋白基因的表达、抑制转化 生长因子 B (transforming growth factor B , TGF B)通路及降 低 平滑肌肌动蛋白(a smooth muscle actin, a SMA) 阳性肌成纤维细胞的活性等。因此，HF是用于联合纳米治 疗的理想药物。金纳米星(gold nanostar, GNS)是呈多枝样结 构的纳米颗粒，其局域等离子体带位于近红外区，光学性质 易于调控，具有良好的光热性能，在光热治疗中是较理想的 光热转换剂。在本研究中，我们以三阴性乳腺癌细胞系4T1 构建裸鼠皮下肿瘤模型，先用HF减少ECM以利于纳米药物 的递送，再

5、注射聚乙二醇(POlyethyIene glycol, PEG)修饰的 GNS(GNS PEG)进行光热治疗，旨在探索三阴性乳腺癌及 其他ECM较为丰富实体肿瘤的纳米治疗新策略。材料与方法一、材料1 .细胞系：鼠源性三阴乳腺癌细胞4T1,购自美国典型培养物保藏 中心(AmeriCan Type Culture Collection, ATCC) o2 .实验动物：BALB/c裸鼠32只，雌性，6周龄，1820g,购于江苏 集萃药康生物科技股份有限公司。3 .主要试剂：氯金酸(HAUCl4)、HCl . AgNO3、柠檬酸三钠 (C6H5Na3O7)及抗坏血酸购自国药集团上海试剂有限公司。 甲氧

6、基封端的疏基聚乙二醇(SHPEGM)购自上海西宝生 物科技有限公司。HF购自上海源叶生物科技有限公司。抗 -SMA. CD31以及TGFB 1抗体购自英国Abcam公司。四甲基偶氮嗖蓝3 （4, 5-Climethylthiazol-2-y 1）-2, 5 dipheny Itetrazolium bromide, MTT购 自美国 Sigma AIdriCh公司。RPMll640培养基、热灭活胎牛血清、二甲基 亚碉和0.05%胰酶一乙二胺四乙酸购自美国Gibco公司。4 .主要仪器：Talos F200X透射电镜为美国FEl公司产品，UV-3600 紫外一可见一近红外分光光度计为岛津企业管理

7、（中国）有限 公司产品，ZetaPALS分析仪为美国Brookhaven公司产品， 220s红外摄像机为中国飞础科软件技术（上海）有限公司产品, 7700电感耦合等离子体光学发射光谱仪/质谱仪为安捷伦科 技（中国）有限公司产品。二、实验方法1 .制备 GNSPEG：采用种子介导法。将0.01 mol/L的HAuC14溶液2.5 ml 加入97.5 ml纯水中，加热至沸腾。在磁力搅拌（900 rmin） 的同时，加入1%柠檬酸三钠水溶液3 ml,继续加热IOmino 冷却至室温，即得到种子液（直径约14 nm）。将12molLHel 5 1、0.01 mol/L HAuC14 0.5 ml 及种

8、 子液 80 1 加入 20 ml 纯水中。在强烈搅拌下，将0l mol/L抗坏血酸IOO l与 0.01 mol/LAgNO3 160 ”同时加入上述溶液中。30 s后，溶 液颜色由浅红色变为蓝黑色，表明GNS已经形成。加入5 mmol/L SH-PEG-M IOO ”，继续搅拌 2 h 以修饰 GNS。 9000 r/min离心20 min收集GNSPEG,于4。C冰箱保存备 用。2 . GNSPEG的表征观察与检测:通过透射电镜观察GNS-PEG的形貌和结构，应用紫外 可见一近红外分光光度计测定GNS的吸收光谱，应用 ZetaPALS分析仪测定GNS及GNS-PEG水动力学尺寸及 zet

9、a电位，通过红外摄像机拍摄热像图并记录GNS-PEG在 激光照射过程中的时间一温度变化。3 . GNSPEG的光热性能测试：使用808 nm激光器,以不同强度(0.5、1.0和1.5 Wcm2) 的激光分别照射0.1 nmol/L GNS-PEG 5 min,用红外摄像机 记录溶液的温度变化，以15 W/Cm2激光照射纯水作为对照， 绘制时间一温度变化曲线。使用808 Iml激光器，以LoW/cm2 的激光照射005 nmol/L GNSPEG 7 mino当温度稳定在最 高温之后，自然冷却至室温，计算光热转化率。光热转化率 =hS(T-T)-QOI(l-10-A) 100%,其中 h 为水的

10、导热 系数，S为光照射面积，T为平衡温度，T为环境温度，QO 为石英比色皿的热传导功率(10.9 mW), I为激光强度，A为 标准光程(1 Cm)下GNS-PEG在808 nm处的吸光度。4 .细胞毒性实验：将4T1细胞接种于96孔板，每孔IXlO4个细胞，培养 24ho (1)检测HF的细胞毒性：将各孔原培养基换为200 l 含有不同浓度(0、31、62、125、250、500 和 1000nmolL)HF 的培养基，孵育48 h后检测细胞活性。(2)检测光热治疗的细 胞毒性：将各孔原培养基换为200 Ul含有不同浓度(0、3、 6、12和25 pmolL)GNS-PEG的培养基，孵育细胞

11、48 h后, 检测细胞活性。将各孔原培养基换为200 Ul含有不同浓度 (0、3、6、12和25 PmOVL)GNSPEG的培养基,孵育细胞24 h后，使用808 nm激光器，以0.5 W/Cm2的激光照射各孔 5 min,检测细胞活性。每组均设置3个复孔。细胞活性检测均采用MTT法。弃去培养基，每孔用磷 酸盐缓冲液(PhoSPhate buffered saline, PBS)清洗 2 遍，弃去 PBS,在每孔中加入10 UlMTT溶液(5mgml),避光孵育4 ho弃去MTT溶液，每孔加入100 IDMSO溶液，振荡混 匀IOmin。使用酶标仪检测每孔57Onm处的吸光度。细胞 活性=实验

12、组吸光度的平均值/对照组吸光度的平均值 100% O5 .建立三阴乳腺癌小鼠模型：制备4T1细胞悬液，调整细胞密度为3X106个/ml。于 BALB/c裸鼠右后肢背部皮下接种4T1细胞悬液,每只0.1 ml06 .肿瘤组织中胶原蛋白、TGFBl和aSMA含量及 血管直径的检测：取6只BALB/c裸鼠建立4T1细胞三阴乳腺癌模型，分 为对照组和HF组，每组3只oHF组小鼠经尾静脉注射75 g/ml HF,每只200 l,每3 d给药1次，共给药5次。对 照组小鼠以相同的方式注射等体积生理盐水。收集肿瘤样本, 切片，行马松染色及TGFBL a -SMA. CD31免疫组化染 色。每张切片随机选取5

13、个感兴趣区，计算胶原蛋白容积分 数及 TGFB 1 和 Ct -SMA 的积分光密度(integrated optical density, IOD)o对于CD31染色的切片，每张切片至少测量 20条血管的直径。7 .肿瘤组织中GNSPEG含量的检测：另取6只BALB/c裸鼠建立4T1细胞三阴乳腺癌模型，分为对照组和HF组，每组3只。HF组小鼠经尾静脉注射 75 gmlHF,每只200 1,每3 d给药1次，共给药5次。 对照组小鼠以相同的方式注射等体积生理盐水。然后，各组 小鼠尾静脉注射5 mg/ml GNS-PEG,每只200 1。24 h后， 收集完整肿瘤，称重后剪碎，加入王水消化溶解标

14、本，加入 超纯水稀释,使其王水含量低于5%, IoOoO r/min离心5 min, 取上清液，即获得待测溶液。采用电感耦合等离子体质谱法 (inductively coupled plasmamass spectrometry, ICP-MS)测 定溶液中金元素的含量，以金元素的含量代表GNS-PEG的 含量，评价肿瘤对GNSPEG的摄取情况。8 .治疗效果评估：将20只BALB/c裸鼠分为对照组、HF组、GNS-PEG 组和 HF+GNSPEG 组，每组 5 只。HF 组和 HF+GNS-PEG 组小鼠经尾静脉注射75 gml HF,每只200 l,每3 d 给药1次，共给药5次。对照组和GNSPEG组小鼠以相同 的方式注射等体积生理盐水。GNS-PEG组和HF+GNS- PEG 组小鼠于治疗开始后第16天经尾静脉注射5 mg/ml GNS-PEG,每只200 l;第17天在小鼠肿瘤部位施以808 nm、0.4 Wcm2的激光照射5 min,每组选取1只小鼠用红 外摄像机记录肿瘤部位的温度变化，获取热像图。对照组和 HF组小鼠第16天经尾静脉注射等量生理盐水，之后不予激 光照射。第18天，每组取1只小鼠处死，剖取肿瘤