色谱柱使用管理标准操作规程.docx

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1、色谱柱使用标准操作规程相关部门职位签字日期(yyyy.mm.dd)起草人QC审核人QC经理QA经理批准人品质管理部总监制作备份1份分发部门QC生效日期回顾日期1 .目的：建立色谱柱使用的标准操作规程，以保证检验结果的准确可靠性。2 .范围：高效液相色谱柱。3 .职责：QC人员必须执行本规程4 .内容：4.1 色谱柱的分类及购买4.1.1分类：高效液相色谱柱通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）简称为C18柱。中国药典中以C18柱最为常用。4.12色谱柱的购买购

2、买前需要了解所分析的化合物的物理及化学性质，如所含化合物的数目、化合物的化学结构（官能团）、化合物的分子量、化合物的PKa值、化合物的UV光谱图、化合物在样品中的浓度范围以及溶解度等等。根据以上化合物的性质，判断所需色谱柱的相应属性，如（以反相柱为例）色谱柱的担体（大多数使用硅胶微粒）、硅胶粒径、硅胶孔径以及A型或B型，键合相的性质，单位质量填料的表面积、含碳量，键合相的键合方式，封端与否、几次封端，以及是否为亲水柱，PH值使用范围等等。以上的信息如果不清楚，可将自己要分析的化合物性质与色谱柱生产厂家联系，他们会有相应的推荐可作为参考。4.1.3每一根新进的购色谱柱购买后需要登记标识色谱柱的应

3、用范围，色谱柱必须造册登记，见附表1,内容包括:生产公司、品名、型号、规格、购进时间、启用时间、单价等。每次使用需登记，见附表2。4.2色谱柱的使用与维护4.2.1色谱柱的安装：安装色谱柱时应使流动相方向与色谱柱标签上箭头所示方向一致，否则可能出现倒峰，并损坏色谱柱。使用PEAK头连接色谱柱时，应使PEAK管头抵到色谱柱两端螺口底部，避免产生死体积导致峰拖尾及柱效下降。4.2.2色谱柱首次使用：有的色谱柱由于出厂后长时间未使用，两端的保存液会有蒸发损失，所以刚购买的色谱柱首次使用时需用甲醇或乙月青冲洗,冲洗量为柱体积的15倍。在连续流出液体前应不接入检测器。4.2.3新购色谱柱在使用前，要进行

4、柱的性能测试，测试液和测试方法可向色谱柱销售员直接索取，如果测试达不到要求，可以依此退货，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。4.2.4使用前准备：4.2.4.1样品的前处理:使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。4.2.4.2流动相的配制:使用色谱纯溶剂配制流动相，水要为超纯化水，使用0.45m滤膜过滤，除去微粒杂质，用前脱气。使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。4.2.5使用4.2.5.1一般的C18柱PH值范围在28,流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相可能降解。一旦发生上述情况，色谱柱入口处会塌陷。同

5、样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相pH较高、较低或经常使用缓冲液时，应该选择使用PH范围大的柱子。4.2.5.2流速的选择：因为柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳的柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1m1min,对于内径为4.Omm柱，流速选择0.8m1in为佳。4.2.5.3柱温一般为常温，有时须配备柱温箱，保证分析结果的重现性，提高柱效，降低柱压，保证检测的稳定性。4.2.5.4开始使用时不可直接用高比例的水冲洗，应逐渐提高水与有机溶剂的比例，使用后应逐渐降低比例。避免流动相组成及极性的

6、剧烈变化。4.2.5.5如果分析用流动相为含盐缓冲液，在使用前应先用与样品所要求流动相比例相似有机溶剂与水平衡色谱柱，再换用流动相。4.2.5.6进行分析前用足够的时间来平衡色谱柱，一般冲洗至基线平稳（波动0.5InAbS）再进样。4.2,5.7分析样品时不仅应注意观察色谱的分析数据，如保留时间，分离度，理论板数，拖尾因子等以及基线情况；还需要观察柱压变化情况，如果有变化应及时调整。4.2.5.8色谱柱的冲洗：使用完含有缓冲液的流动相，先用与样品所要求流动相比例相似有机溶剂与水充分冲洗色谱柱，约15倍的柱体积，再用甲醇或乙脯冲洗保存。4.2.6色谱柱使用注意事项：4.2.6.1如果不是亲水型色

7、谱柱，不能用小于5%的有机相作为流动相，易造成疏水坍塌色谱柱柱效急剧下降且不能更原。4.2.6.2色谱柱不能发生剧烈震荡，容易使柱床断裂，造成肩峰，柱效下降，导致报废。4.2.6.3使用色谱级溶剂，可提高色谱柱的分析性能，延长色谱柱的使用寿命。4.2.6.4为保证固定产品的检验稳定性与及时性，色谱柱一般都有规定的使用的检验品种，不可随意混用。4.2.6.5如果色谱柱长时间不用，应定期（约1个月）用甲醉冲洗避免柱床发生干裂导致报废。4.2.7色谱柱的维修及再生：4.2.7.1常见色谱峰型不对称（拖尾或前延）色谱柱原因：a.色谱柱堵塞筛板污染b.进口处填料有凹陷（色谱柱坍塌）；c.“污物”在柱进口

8、处积聚；d.色谱柱填料存在强吸附（死吸附）；e.重金属污染；f,键合相脱落，硅羟基效应；4.2.7.2根据上述原因，用以下方法维修及再生：a.更换筛板或将筛板超声处理清洗干净；b.小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出12mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。c.如果厂家说明书允许，可用乙月青将色谱柱反冲，反冲时流速不可过高，以0.5为宜，冲洗1小时。d.对于填料存在强吸附的再生：去除脂类可用四氢吠喃、乙脯或甲醇洗涤;去除蛋白质可用乙月青、丙醇和1%三氯乙酸

9、进行梯度洗脱;一些高疏水性化合物可用乙盾或甲醇洗脱,同时反亚注入100-200mI的四氢吠喃。4.3色谱柱的报废：4.3.1色谱柱失效的一些情况：a.色谱柱柱压增高；b.色谱峰拖尾；c.塔板数下降；d.选择性下降e.保留值减小（或碱性化合物在硅胶基质柱上增大）4.3.2报废：经再生和维修后仍然无法恢复的色谱柱应报废。报废的色谱柱应有明显标识，不可随意丢弃，留待维修其他同类色谱柱用。注：1.色谱柱是HP1C分离的有效分离部分，但是整个液相系统对其分离非常大，如流动相性质，样品的性质，仪器的死体积，管路的清洁度等等。所以，如果发现有问题应从整个HP1C系统中寻找原因。2,此操作规程以常用的CI8、C8反相柱为例，如果用到正相柱或特殊柱特殊柱请参考相应的说明书。5.文献5.1 实用高效液相色谱法的建立6.变更历史版本号生效日期修订内容备注/