消毒产品消毒效果检验技术规范.docx

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1、消毒产品消毒效果检验技术规范1消毒剂杀微生物试验1.1 适用范围主要适用于消毒剂鉴定和日常监测，用来评价各种用途的消毒剂对微生物的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒剂的杀菌能力的重要方面进行验证，侧重反映消毒剂的实用剂量与杀菌能力。不能反映消毒剂的全面特性。1.2 菌悬液与菌片的制备1.2.1 适用范围制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片，以供消毒剂杀菌试验时使用。1.2.2 试验器材(1)菌种:金黄色葡萄球菌ATeC6538、铜绿假单胞菌ATCe15442、大肠杆菌8099、枯草杆菌黑色变种ATCC9372、龟分枝杆菌脓肿亚种ATeC93326、白色葡萄球菌8032、白色念珠菌ATeC1

2、o231、黑曲霉菌ATCC16404o在上述规定的菌株基础上，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。(2)有机干扰物：见附录A。(3)磷酸盐缓冲液：见附录A。(4)无菌蒸储水。(5)稀释液：见附录A。(6)细菌培养基：胰蛋白陈大豆琼脂培养基(TSA),胰蛋白陈大豆肉汤培养基(TSB)等，见附录A。(7)革兰染色液：见附录A。(8)芽胞染色液：见附录A。(9)恒温水浴箱。(10)玻璃漏斗。(11)刻度吸管(1.0m1、5.0m1、10.0m1),毛细吸管。(12)数字可调移液器(101,201,1001,2001,10001)及配套用一次性塑料吸头。(13)离心机。(14)电动混合

3、器(15)浊度计。1.2.3 细菌悬液制备程序(1)细菌繁殖体悬液的制备1)取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0m1-10.0m1营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37培养18h24h0用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37。C培养18h24h0挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37培养18h24h,即为第3代培养物。2)取菌种第3代14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(18h24h),用5.0m1吸管吸取3.0m15.0m1稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用

4、5.0m1吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合(振荡)20s,或在手掌上振敲80次，以使细菌悬浮均匀。3)初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。4)细菌繁殖体悬液应保存在4冰箱内备用。应当天使用不得过夜。5)怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。(2)细菌芽胞悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5m1IOmI营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37培养18h24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于3

5、7培养18h24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于37培养18h24h,即为第3代培养物。2）用10.Om1吸管吸取5.0m110.Om1第3代5代的18h24h营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面，再将多余肉汤培养物吸出，将罗氏瓶置于37温箱内，培养5d-7d03）用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽胞染色法染色，并在显微镜（油镜）下进行镜检。当芽抱形成率达95%以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定时间，直至达到上述芽抱形成率后再进行以下处理。改良芽抱染色法：用接种环取菌样涂布于玻片上，待

6、自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片o将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴加足量的5.0%孔雀绿水溶液。将平皿盖好，放5456条件下，加热30mino取出，去滤纸，用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。加0.5%沙黄水溶液，染Imin。水洗，待干后镜检。芽抱呈绿色，菌体呈红色。4）罗氏瓶培养物，用10.OmI吸管加10.OmI无菌蒸储水于每一罗氏瓶中，以1棒轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再向瓶内吸加5.0m1无菌蒸储水，重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5min,打碎菌块，使成均匀的芽抱悬液。5）必要时，将盛装菌悬液的三角烧瓶置45水浴中24h,

7、使菌自溶断链，分散成单个芽抱。6）用无菌棉花或纱布过滤芽抱悬液，清除其中的琼脂凝块。7）将过滤后的芽抱悬液，置无菌离心管内，以3000rmin速度离心30mino弃上清液，加蒸储水吹吸使芽胞重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共3遍。8）将洗净的芽抱悬浮于三角烧瓶内蒸储水中，并加入适量小玻璃珠。9）将芽抱液放于80水浴中IOmin（或60C,30min）,以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于4冰箱中备用。有效使用期为半年。10）芽抱悬液在使用时，应先进行活菌培养计数。）怀疑有杂菌污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。1.2.4 菌片的制备程序（1）消毒试验中使用的菌片是

8、以菌液滴加于载体上制成。载体应根据消毒对象选择，常用的有金属、玻璃、滤纸、线、棉布等。根据其特点选择适宜材料载体作为代表。载体可以为方形，大小为IOmmx1Ommo当以金属片为载体时，因方形金属载体在振敲时可将玻璃试管撞碎，故改用12mm直径圆形金属片（厚0.5mm）O（2）所用载体（除滤纸片外）于染菌前，应进行脱脂处理。脱脂方法如下：将载体放在含洗涤剂的水中煮沸30min；以自来水洗净；用蒸储水煮沸IOmin;用蒸储水漂洗至PH呈中性；晾干、熨平备用。（3）布片用白平纹棉布制作。在剪开前，先将脱脂的布块按载体规定的大小，抽去边缘一周的经纬纱各一根，再按抽纱痕剪开。此法制成的载体大小一致，且无

9、毛边。金属片以不锈钢制作，纸片以新华滤纸制作。（4）载体经压力蒸汽灭菌后，使用滴染法染菌。染菌用菌悬液：使用TSB营养肉汤配制。细菌繁殖体，可直接使用经18h24h培养的斜面培养物，细菌芽抱可使用4冰箱贮存液。含菌量约为1x1（）8cfum15x1（）8cfum1,可使用浊度计调整菌液浓度。滴染法染菌时，将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内，逐片滴加菌液。菌液滴加量每片为1010用101移液器接灭菌塑料吸头滴染菌液，并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，染菌载体可置37温箱内干燥（约20min30min）,或置室温下自然阴干后再使用。（5）每个菌片的回收菌数，按活菌培养计数所得结果，应为5x15

10、CfU/片5x106CfU/片。1.2.5 注意事项(1)用浊度计测定的菌悬液浓度，只用于在滴染菌片时对菌悬液稀释度的估计。作为菌悬液含菌浓度或菌片染菌量的正式报告(如杀菌试验中阳性对照组菌悬液或菌片所含菌量)，必须以活菌培养计数的实测结果为准，不得使用根据比浊法判定的估计值。(2)滴染时，菌液滴加量不宜过多，避免流散影响染菌的准确性。(3)细菌繁殖体在烤干过程中，可引起部分死亡，如铜绿假单胞菌在37干燥过程中，滴度最高可下降1个对数值。此时，应提高初始菌浓度，以便达到所需的菌量。(4)配制菌悬液和制备菌片时，严格按无菌要求操作，以防污染杂菌，影响随后杀菌试验的结果。(5)用带橡皮塞的容器保存

11、菌液时，应将其预先煮沸IOmin进行脱硫处理。(6)制得的菌悬液和菌片，用毕应随时放入冰箱内，尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。1.3 活菌培养计数技术1.3.1 适用范围测定细菌悬液、菌片、采样液等样本中含有活菌的数量。1.3.2 试验器材(1)刻度吸管(1.0m1、5.0m1)0(2)稀释液：见附录A。(3)营养琼脂培养基：见附录A。(4)电动混合器1.3.3 操作程序本规范要求在杀菌试验中的活菌培养计数统一使用倾注法。其操作程序如下。(1)对菌悬液可直接进行培养计数。对菌片、采样棉拭与小型固体样本等，应将其上的细菌洗下成为菌悬液后进行培养计数。洗菌时，一般以稀释液为洗液。具

12、体方法如下：取含5.0m1稀释液无菌试管，对菌片或小型固体样本直接投入即可，对棉拭则将其采样端剪入管内，每管一份样本。而后，用电动混合器混合20s(或在手掌上用力振敲80次)，将菌洗下形成菌悬液。以上操作应严格按无菌要求进行。(2)将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入4.5m1稀释液。各组由左向右,逐管标上IO/、10-2、10-3等。(3)将菌悬液样本在用电动混合器混合20s(或在手掌上用力振敲80次)，随即吸取0.5m1加至10管内。(4)将IO管依前法用电动混合器混合20s(或在手掌上用力振敲80次)，混匀，再吸取出0.5m1加入IO?管内。如此类推，直至最后一管。必要时，还可作

13、某稀释度的1:1或1:4稀释。(5)选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为15CfU300CfU者为宜)，吸取其中混合均匀的悬液1Om1加于无菌平皿内。每一稀释度接种3个平皿。一般需接种2个3个不同稀释度。平皿加样前，应先按组编号，以免弄混。(6)将冷至4045的熔化营养琼脂培养基，倾注于已加入样液的平皿中，每平皿15m120m1。(7)将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放于台上。待琼脂凝固后，翻转平皿，使底向上，置37温箱内培养。(8)每日观察细菌生长情况。培养至规定时间(细菌繁殖体为48h,白色念珠菌与细菌芽抱为72h),计数最终结果的菌落数。(9)对菌片和采样棉拭洗液的活菌培养计数，

14、先按各试验要求处理(如去除残留消毒剂等)，而后取其最终样液按上法进行培养计数。(10)计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15CfU300CfU的平板为准，每个稀释度3个平板生长菌落数全合乎上述标准，则以该3个平板的菌落平均值作为结果；若有2个符合上述标准，则以该合格的两个平板菌落的平均值为结果。但对黑曲霉菌活菌计数及杀灭试验时，平板菌落数应在15cfu1（X）CfU之间。对估计菌量极少的样本（如消毒处理后样本），在培养计数时可不作稀释，即使平板菌落数未达15时，亦可用其计算最终结果。将求得的平均菌落值，再乘以稀释倍数，即得每毫升原样液中的菌量。菌量单位为cfu。1.3.

15、4 活菌计数中技术操作误差的测定试验者在活菌计数中因技术操作而引起的菌落数误差率（平板间、稀释度间）不宜超过10%。对误差率的自检，可按以下公式计算。（I）平板间误差率计算公式：平板间误差率=平板间菌落数平均差平板间菌落平均数100%平板间菌落数平均差=（平板间菌落平均数当菌落数）的绝对值之和平板数平板间菌落平均数=各平板菌落数之和平板数（2）稀释度间误差率计算公式:稀释度间菌落平均差=（稀释度间菌落平均数各稀释度菌落数）的绝对值之和稀释度数稀释度间菌落平均数=1.3.5注意事项各稀释度平均菌落数之和稀释度数（1）严格无菌操作，防止污染。（2）认真检查试验器材有无破损（要特别注意试管底的裂痕和破洞），以防丢失样本和污染环境。（3）注意菌液的均匀分散。（4）稀释或取液时要准确，尽量减少吸管使用中产生的误差。（5）每吸取一个稀释度样液，必须更换一支吸管，以减少误差。（6）样液接种于平皿后应尽快倾注营养琼脂培养基，避免样液干燥于平皿上，影响结果的准确性。（7）倾注时琼脂培养基温度不得超过45,以防损伤细菌或真菌。倾注和摇动时，动作应尽量平稳，以利细菌分散均匀，便于计数菌落。勿使培养基外溢，以免影响结果的准确