消毒产品消毒效果检验技术规范.docx
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1、消毒产品消毒效果检验技术规范1消毒剂杀微生物试验1.1 适用范围主要适用于消毒剂鉴定和日常监测,用来评价各种用途的消毒剂对微生物的杀灭效果。按此方法进行的试验,只是对消毒剂的杀菌能力的重要方面进行验证,侧重反映消毒剂的实用剂量与杀菌能力。不能反映消毒剂的全面特性。1.2 菌悬液与菌片的制备1.2.1 适用范围制备消毒剂杀菌试验用细菌悬液与菌片,以供消毒剂杀菌试验时使用。1.2.2 试验器材(1)菌种:金黄色葡萄球菌ATeC6538、铜绿假单胞菌ATCe15442、大肠杆菌8099、枯草杆菌黑色变种ATCC9372、龟分枝杆菌脓肿亚种ATeC93326、白色葡萄球菌8032、白色念珠菌ATeC1
2、o231、黑曲霉菌ATCC16404o在上述规定的菌株基础上,根据消毒剂特定用途或试验特殊需要,还可增选其他菌株。(2)有机干扰物:见附录A。(3)磷酸盐缓冲液:见附录A。(4)无菌蒸储水。(5)稀释液:见附录A。(6)细菌培养基:胰蛋白陈大豆琼脂培养基(TSA),胰蛋白陈大豆肉汤培养基(TSB)等,见附录A。(7)革兰染色液:见附录A。(8)芽胞染色液:见附录A。(9)恒温水浴箱。(10)玻璃漏斗。(11)刻度吸管(1.0m1、5.0m1、10.0m1),毛细吸管。(12)数字可调移液器(101,201,1001,2001,10001)及配套用一次性塑料吸头。(13)离心机。(14)电动混合
3、器(15)浊度计。1.2.3 细菌悬液制备程序(1)细菌繁殖体悬液的制备1)取冻干菌种管,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散。取含5.0m1-10.0m1营养肉汤培养基试管,滴入少许菌种悬液,置37培养18h24h0用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于营养琼脂培养基平板上,于37。C培养18h24h0挑取上述第2代培养物中典型菌落,接种于营养琼脂斜面,于37培养18h24h,即为第3代培养物。2)取菌种第3代14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(18h24h),用5.0m1吸管吸取3.0m15.0m1稀释液加入斜面试管内,反复吹吸,洗下菌苔。随后,用
4、5.0m1吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混合器混合(振荡)20s,或在手掌上振敲80次,以使细菌悬浮均匀。3)初步制成的菌悬液,先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度,然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。4)细菌繁殖体悬液应保存在4冰箱内备用。应当天使用不得过夜。5)怀疑有污染时,应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。(2)细菌芽胞悬液的制备1)取冻干菌种管,在无菌操作下打开,以毛细吸管吸加适量营养肉汤培养基,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散。取含5m1IOmI营养肉汤培养基试管,滴入少许菌种悬液,置37培养18h24h。用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于营养琼脂培养基平板上,于3
5、7培养18h24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落,接种于营养肉汤培养基,于37培养18h24h,即为第3代培养物。2)用10.Om1吸管吸取5.0m110.Om1第3代5代的18h24h营养肉汤培养物,接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面,将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面,再将多余肉汤培养物吸出,将罗氏瓶置于37温箱内,培养5d-7d03)用接种环取菌样少许涂于玻片上,固定后以改良芽胞染色法染色,并在显微镜(油镜)下进行镜检。当芽抱形成率达95%以上时,即可进行以下处理。否则,应继续在室温下放置一定时间,直至达到上述芽抱形成率后再进行以下处理。改良芽抱染色法:用接种环取菌样涂布于玻片上,待
6、自然干燥。而后通过火焰加热将菌固定于玻片o将涂片放入平皿内,片上放两层滤纸,滴加足量的5.0%孔雀绿水溶液。将平皿盖好,放5456条件下,加热30mino取出,去滤纸,用自来水冲洗残留孔雀绿溶液。加0.5%沙黄水溶液,染Imin。水洗,待干后镜检。芽抱呈绿色,菌体呈红色。4)罗氏瓶培养物,用10.OmI吸管加10.OmI无菌蒸储水于每一罗氏瓶中,以1棒轻轻推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液,再向瓶内吸加5.0m1无菌蒸储水,重复洗菌一遍。将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中,振摇5min,打碎菌块,使成均匀的芽抱悬液。5)必要时,将盛装菌悬液的三角烧瓶置45水浴中24h,
7、使菌自溶断链,分散成单个芽抱。6)用无菌棉花或纱布过滤芽抱悬液,清除其中的琼脂凝块。7)将过滤后的芽抱悬液,置无菌离心管内,以3000rmin速度离心30mino弃上清液,加蒸储水吹吸使芽胞重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗,先后共3遍。8)将洗净的芽抱悬浮于三角烧瓶内蒸储水中,并加入适量小玻璃珠。9)将芽抱液放于80水浴中IOmin(或60C,30min),以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后,保存于4冰箱中备用。有效使用期为半年。10)芽抱悬液在使用时,应先进行活菌培养计数。)怀疑有杂菌污染时,应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。1.2.4 菌片的制备程序(1)消毒试验中使用的菌片是
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