细胞内清除ROS的测定.docx

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1、1 .细胞内清除ROS的测定。采用活性氧检测试剂盒评价样品的ROS清除能力。将过氧化氢和水凝胶悬液（DMEM）加入到6孔板中培养的HDFa细胞中。12h后，加入DACH-DA探针，孵育30min,然后在荧光显微镜下观察细胞。2 .体外人角质形成细胞（HaCaT细胞）、人皮肤成纤维细胞（HDFS）和人动脉内皮细胞（HAECS）增殖和迁移试验。迁移实验：将人角质形成细胞（HaCaT细胞）、人皮肤成纤维细胞（HDFS）和人动脉内皮细胞（HAECS）细胞接种于6孔板中，培养覆盖孔，在细胞单层上产生划伤。将细胞与水凝胶悬液在37下孵育，并对细胞迁移状态进行数字成像。3 .细胞相容性评价。人角质形成细胞（

2、HaCaT细胞）、人皮肤成纤维细胞（HDFS）和人动脉内皮细胞（HAECS）,通过活/死和CCK8试验评价水凝胶的细胞相容性。在活/死试验中，将1001的水凝胶加入到96孔培养板中进行凝胶化，并将HUVECs或HFFs（每孔1104个细胞）接种于水凝胶表面。培养24h后，用活/死培养液替换培养基，将平板置于细胞培养箱中30min。然后在共聚焦显微镜下观察细胞。在CCK-8试验中，首先将细胞接种于96孔培养板中（每孔1104个细胞）进行粘附。培养24h后，用不同的水凝胶提取物替代培养液（用DMEM将水凝胶浸泡24h获得）。使用CCK-8检测试剂盒检测水凝胶的细胞相容性。4 .水凝胶介导的溶血评价

3、。为了评估水凝胶介导的溶血作用，将红细胞离心IOmin。然后，用PBS冲洗三次，稀释至5%Wv的浓度。用组织研磨机将冻干后的水凝胶粉碎，制备四种等浓度的水凝胶溶液。然后将0.5m1水凝胶溶液和500u1RBC悬液引入3m1管中混合，37持续摇晃Ih,然后离心IOmin。将获得的上清液进一步离心去除水凝胶颗粒，然后用酶标仪在540nm处读取ABSo0.1%TritOnX-IOo为阳性对照，PBS为阴性对照。5 .体内糖尿病伤口愈合实验。禁食10h后，腹腔注射50mg/kg的STZ溶液（50mgm1）1周后，选择血糖高于16.7mmo1/1的大鼠进行1型糖尿病模型。31在糖尿病大鼠的背部建立一个直径为0.8Cm的全层创面，随机分为4组（每组3只）。每3天用水凝胶或商业敷料治疗伤口，并记录创面面积。为进一步研究创面愈合情况，收集用水凝胶或PBS处理过的创面，用4%甲醛固定。采用血氧谱系红蛋白（H&E）染色、MaSSOn染色进行组织学分析，。