清香型小曲白酒酿造中酵母资源解析及其耐受性能研究.docx

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1、清香型小曲白酒酿造中酵母资源解析及其耐受性能研究酵母是白酒酿造中三大主要功能微生物类群之一，其在糖化和发酵过程中数量与种类不断变化，促进了底物转化为乙醇并形成多种香味物质口-2。在我国，由于地理环境和酿造工艺的不同使得白酒在发展中形成了多种香型，如清香型、浓香型和酱香型，从而导致酵母菌群的种类、分布也存在一定的差异3-5。相比于酱香和浓香型白酒，对清香型白酒中酵母种类研究较少，主要集中在酿酒酵母、汉逊酵母、东方伊萨酵母及假丝酵母等6-8。因此，从清香型白酒酒曲清香型小曲白酒酿造中酵母资源解析及其耐受性能研究酵母是白酒酿造中三大主要功能微生物类群之一，其在糖化和发酵过程中数量与种类不断变化，促进

2、了底物转化为乙醇并形成多种香味物质口-2。在我国，由于地理环境和酿造工艺的不同使得白酒在发展中形成了多种香型，如清香型、浓香型和酱香型，从而导致酵母菌群的种类、分布也存在一定的差异3-5。相比于酱香和浓香型白酒，对清香型白酒中酵母种类研究较少，主要集中在酿酒酵母、汉逊酵母、东方伊萨酵母及假丝酵母等6-8。因此，从清香型白酒酒曲形态学和26SrRNA分子生物学技术鉴定其种属。筛选的酵母的生理特性和环境耐受性进行研究，型小曲白酒生产储备优良酵母资源。同时，对所以期为清香1材料与方法1.1 仪器与设备E200生物显微镜，尼康；2720ThermalCyclerPCR仪，赛默飞世尔科技；DYY-8C电

3、泳仪，北京六一生物科技有限公司;ZF-288全自动凝胶成像分析系统，上海嘉鹏科技有限公司;5424R离心机，Eppendorf公司；WFJ2000可见分光光度计,尤尼柯（上海）仪器有限公司；6000电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；MJ-250BSH-霉菌培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-1B净化工作台，苏州智净净化设备有限公司；YXQ-LS-75SII高压灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。1.2 材料与试剂1.2. 1实验样品和试剂分离酵母所用酒醋样品于2022年1012月取自劲牌公司枫林三分厂酿造三车间，酒曲取自劲牌毛铺制曲车间。生化试剂：PDA培养基，海博生物技术有限

4、公司；孟加拉红琼脂培养基、蛋白脓、琼脂粉，国药集团化学试剂有限公司；酵母浸粉，北京奥博星生物技术有限公司；青霉素，华北制药股份有限公司；黄豆芽，超市购买；麦芽浸粉，天津市利发隆化工科技有限公司。分析纯试剂：葡萄糖、丙酸钠、乳酸、乙酸、脱氧胆酸钠、KH2P04. K2HP04. MgS04. KNO3、 Na2HP04. NaH2P04. KC1、国药并加FeS04.蔗糖、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、甘油,集团化学试剂有限公司。1.2.2培养基及试剂配制PDA培养基：按照PDA合成培养基配方称取适量样品,入10gL的丙酸钠加热溶解，倾倒平板前加入0.5gL的青霉素或3. 3mLL的乙酸

5、19（下同）。YPD培养基（g/L）：酵母浸粉10,葡萄糖20,蛋白陈20,琼脂20,倾倒平板前加入0.5gL的青霉素。分别加入0.3gL脱氧胆酸钠，或3. 3mLL的乙酸，或V（乙酸）：V（乳酸）=1 ： 1（乙酸3 0mLL）,或V（乙酸）：V（乳酸）=1 ： 2（乙酸23mLL）, V（乙酸）：V（乳酸）二1 ： 3（乙酸 2.0mLL）孟加拉红培养基（g/L）：蛋白陈5,葡萄糖10, KH2P041,无水MgS040. 5,孟加拉红0. 033,琼脂20o倾倒平板前加入0. 5gL的青霉素。分别加入0. 3gL脱氧胆酸钠，或3. 3mLL的乙酸。察氏培养基（g/L）：蔗糖 30, Na

6、N033, K2HP041, MgS040. 5,KC10. 5, FeS040.01,琼脂 20。豆芽汁葡萄糖培养基（g/L）：黄豆芽100,葡萄糖50,琼脂20o称取新鲜黄豆芽100g,置于烧杯中，加入1000mL水，发隆化工科技有限公司。分析纯试剂：葡萄糖、丙酸钠、乳酸、乙酸、脱氧胆酸钠、KH2P04. K2HP04. MgS04. KNO3、 Na2HP04. NaH2P04. KC1、国药并加FeS04.蔗糖、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、甘油,集团化学试剂有限公司。1.2.2培养基及试剂配制PDA培养基：按照PDA合成培养基配方称取适量样品,入10gL的丙酸钠加热溶解，倾倒

7、平板前加入0.5gL的青霉素或3. 3mLL的乙酸19（下同）。YPD培养基（g/L）：酵母浸粉10,葡萄糖20,蛋白陈20,琼脂20,倾倒平板前加入0.5gL的青霉素。分别加入0.3gL脱氧胆酸钠，或3. 3mLL的乙酸，或V（乙酸）：V（乳酸）=1 ： 1（乙酸3 0mLL）,或V（乙酸）：V（乳酸）=1 ： 2（乙酸23mLL）, V（乙酸）：V（乳酸）二1 ： 3（乙酸 2.0mLL）孟加拉红培养基（g/L）：蛋白陈5,葡萄糖10, KH2P041,无水MgS040. 5,孟加拉红0. 033,琼脂20o倾倒平板前加入0. 5gL的青霉素。分别加入0. 3gL脱氧胆酸钠，或3. 3mL

8、L的乙酸。察氏培养基（g/L）：蔗糖 30, NaN033, K2HP041, MgS040. 5,KC10. 5, FeS040.01,琼脂 20。豆芽汁葡萄糖培养基（g/L）：黄豆芽100,葡萄糖50,琼脂20o称取新鲜黄豆芽100g,置于烧杯中，加入1000mL水，发隆化工科技有限公司。分析纯试剂：葡萄糖、丙酸钠、乳酸、乙酸、脱氧胆酸钠、KH2P04. K2HP04. MgS04. KNO3、 Na2HP04. NaH2P04. KC1、国药并加FeS04.蔗糖、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、甘油,集团化学试剂有限公司。1.2.2培养基及试剂配制PDA培养基：按照PDA合成培养基

9、配方称取适量样品,入10gL的丙酸钠加热溶解，倾倒平板前加入0.5gL的青霉素或3. 3mLL的乙酸19（下同）。YPD培养基（g/L）：酵母浸粉10,葡萄糖20,蛋白陈20,琼脂20,倾倒平板前加入0.5gL的青霉素。分别加入0.3gL脱氧胆酸钠，或3. 3mLL的乙酸，或V（乙酸）：V（乳酸）=1 ： 1（乙酸3 0mLL）,或V（乙酸）：V（乳酸）=1 ： 2（乙酸23mLL）, V（乙酸）：V（乳酸）二1 ： 3（乙酸 2.0mLL）孟加拉红培养基（g/L）：蛋白陈5,葡萄糖10, KH2P041,无水MgS040. 5,孟加拉红0. 033,琼脂20o倾倒平板前加入0. 5gL的青霉

10、素。分别加入0. 3gL脱氧胆酸钠，或3. 3mLL的乙酸。察氏培养基（g/L）：蔗糖 30, NaN033, K2HP041, MgS040. 5,KC10. 5, FeS040.01,琼脂 20。豆芽汁葡萄糖培养基（g/L）：黄豆芽100,葡萄糖50,琼脂20o称取新鲜黄豆芽100g,置于烧杯中，加入1000mL水，发隆化工科技有限公司。分析纯试剂：葡萄糖、丙酸钠、乳酸、乙酸、脱氧胆酸钠、KH2P04. K2HP04. MgS04. KNO3、 Na2HP04. NaH2P04. KC1、国药并加FeS04.蔗糖、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、甘油,集团化学试剂有限公司。1.2.2

11、培养基及试剂配制PDA培养基：按照PDA合成培养基配方称取适量样品,入10gL的丙酸钠加热溶解，倾倒平板前加入0.5gL的青霉素或3. 3mLL的乙酸19（下同）。YPD培养基（g/L）：酵母浸粉10,葡萄糖20,蛋白陈20,琼脂20,倾倒平板前加入0.5gL的青霉素。分别加入0.3gL脱氧胆酸钠，或3. 3mLL的乙酸，或V（乙酸）：V（乳酸）=1 ： 1（乙酸3 0mLL）,或V（乙酸）：V（乳酸）=1 ： 2（乙酸23mLL）, V（乙酸）：V（乳酸）二1 ： 3（乙酸 2.0mLL）孟加拉红培养基（g/L）：蛋白陈5,葡萄糖10, KH2P041,无水MgS040. 5,孟加拉红0.

12、033,琼脂20o倾倒平板前加入0. 5gL的青霉素。分别加入0. 3gL脱氧胆酸钠，或3. 3mLL的乙酸。察氏培养基（g/L）：蔗糖 30, NaN033, K2HP041, MgS040. 5,KC10. 5, FeS040.01,琼脂 20。豆芽汁葡萄糖培养基（g/L）：黄豆芽100,葡萄糖50,琼脂20o称取新鲜黄豆芽100g,置于烧杯中，加入1000mL水，Tablelldentificationresultsofdifferenttypesofyeast注：/,未鉴定成功;-,无参考文献对应2. 2分离纯化的酵母在平板上的菌落形态特征如图1所示，酿酒酵母呈乳白色圆形，有光泽，边缘

13、整齐,显微下为圆球形。季也蒙毕赤酵母呈白色奶油状，平滑湿润有光泽，显微下为圆球形；发酵毕赤酵母呈乳白色无光泽,边缘不整齐，菌落凸起，有褶皱，单个酵母细胞为椭圆形;库德里阿兹威毕赤酵母菌落形态为奶油白色圆形，边缘呈齿蚀状，菌体凸起有褶皱，显微下为椭圆形；膜璞毕赤酵母为乳白色，边缘不整齐，菌落凸起有褶皱，单个酵母细胞呈梭形和卵圆形；外岛毕赤酵母为乳白色，边缘不整齐有短小绒毛，菌落凸起有褶皱，单个酵母细胞为卵圆形。这几类酵母在白酒风味物质形成中具有重要的作用24。异常威克汉逊酵母菌落呈奶油白色圆形，边缘环纹起皱，菌体黏稠，显微下为卵圆形和椭圆形；扣囊腹膜泡酵母菌落形态为白色圆形,质地呈短绒毛状，菌落

14、边缘呈齿蚀状，显微下为卵圆形，有假菌丝和子囊抱子；白地霉呈奶白色圆形，表面绒毛状，生长直径可达2cm左右，显微下能观察到横隔和节抱子，抱子形状为长筒形，末端钝圆。阿氏丝抱酵母、A. loubieri和T. loubieri均为丝泡酵母属下不同种。阿氏丝泡酵母为白色圆形，无光泽有凸起，呈脑回状，菌落边缘呈齿蚀状，显微下为圆形，长杆形、末端钝圆，有假丝和厚垣袍子；A. loubieri为淡黄色，菌落隆起无光泽，边缘整齐，单个细胞为球形或短矩圆形，有假菌丝。T. loubieri菌落早期为乳白色，菌体湿润，边缘不整齐，中间凸起，后期菌落渐渐变黄，菌体干燥，可见伸入培养基假菌丝，单个酵母细胞为圆球形，

15、有假菌丝，并可见椭圆形和柱状的关节抱子。近玫色锁掷袍酵母呈橘红色圆形，光滑湿润，边缘整齐，显微形态为圆形和椭圆形。2.3酵母菌株生理生化实验如表2所示，糖发酵结果表明大多数酵母均可发酵葡萄糖、蔗糖，或对葡萄糖、蔗糖有可变反应；能发酵麦芽糖的酵母占一半，仅扣囊腹膜抱酵母(J-6)发酵可溶性淀粉,T.loubieri-39)发酵乳糖和海藻糖；阿氏丝袍酵母(J-5)和膜璞毕赤酵母(J-26)均不发酵这6种糖类。氮源同化实验结果表明A. loubieriT. loubieri白地霉、膜璞毕赤酵母、扣囊腹膜抱酵母和发酵毕赤酵母对硝酸钠具有同化作用，其余酵母对硝酸盐不具有同化作用。腺酶实验结果表明发酵毕赤酵母和近玫色锁掷抱酵母为腺酶产生菌株，其余菌株为不