PCR反应污染原因追踪及污染处理方法.docx

《PCR反应污染原因追踪及污染处理方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR反应污染原因追踪及污染处理方法.docx（3页珍藏版）》请在第一文库网上搜索。

1、PCR反应污染原因追踪及污染处理方法PCR反应的特点是具有较大扩增能力与灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。1、污染原因1、标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。2、PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。3、PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要的污染问题.因为PCR产物拷

2、贝量大(一般为1013拷贝/m1),远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。4、实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活

3、细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大。污染的监测：一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。2、污染处理1环境污染稀酸处理法：对可疑器具用ImOI/1盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱喋吟。紫外照射(UV)法：紫外波长(nm)一般选择254/30Onm,照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对50ObP以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中喀咤碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有

4、喀咤均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，喀咤二聚体的类型及与二聚体位点相邻核昔酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤(如环丁烷型喀咤复合体，胸腺喀咤乙二醇，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等)均可终止TaqDNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个50ObP片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果IoobP的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分

5、子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。2 .反应液污染可采用下列方法之一处理：（I）DNaseI法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UDNaseI,室温反应30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列。（2）内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如MSP1和Taq1等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用Ih后加热灭活进行PCR。紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法。（4）g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏

6、0.1ng基因组DNA,2.0kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0kGy仍不影响PCR,但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR,g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。3 .尿喀咤糖甘酶（UNG）法由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为30ObP左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。（1）原理：在PCR产物或引物中用d代替dT.这种d化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿喀咤碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去d而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的

7、模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嚏咤，而对RNA中的尿喀咤和单一尿喀咤分子则无任何作用。（2）dUTP法：用dUTP代替dTTP,使产物中掺入大量dU.在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含d的新的PCR产物。dU引物法：合成引物时以dU代dT,这样PCR产物中仅5端带dU.UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，而用d法就可克服这一缺点。d引物最好将d设计在3端或近端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。优点：可以

8、去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR产物克隆时,应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。4 .固相捕获法用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：(1)用一生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区。(2)用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质。(3)洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第步的漂洗后可用PCR检测以确定标本

9、是否被扩增产物或重组质粒污染。5 .RS-PCR(RNA-specificPCR)也称为链特异性PCR,主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3端(A区)有2O个核甘酸左右为模板的特异性互不序列，5端2O个核甘酸(C区)为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使CDNA与多余引物分开,再用和第二引物。以第一链CDNA为模板合成第二链cDNA,以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾CDNA,而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。6 .抗污染引物法该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的,该法试用于环状靶分子系列。