过氧化物酶PeroxidasePOD试剂盒说明书.docx

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1、过氧化物酶（PeroXidaSaPOD）试剂盒说明书微法100管/96样注意s正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义：POD（EC1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。渊定原理：POD催化H2O2氧化特定底物，在470nm有特征光吸收。需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水试剂的组成：提取液：液体IoOm1X1瓶，4匕保存：试剂一：液体25m1x1瓶，4保存；试剂二：液体10011支,4C保存；试剂三

2、：液体10011支，4保存。粗液提取：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（IO4个）：提取液体积（m1）为5001000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入Im1提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次）；8000g4C离心IOmin,取上清，置冰上待测。组织：按照组织质量（g）：提取液体积（m1）为1：570的比例（建议称取约0.1g组织，加入Im1提取液），进行冰浴匀浆。8000g4已离心IOmin,取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。测定步骤：1、

3、分光光度计或衡标仪预热30min以上，调节波长至470nm,蒸储水调零。2、工作液的配制：临用前将试剂一、试剂二、试剂三按照2.6（m1）：1.5（1）:1（1）的比例混匀；在37X:（哺乳动物）或25（其它物种）预热IOmin以上：现配现用。3、在微量石英比色皿或96孔板中加入101样本和1901工作液，混匀，记录470nm卜.Imin时吸光值A1和2min后的吸光值A2。计算A=A2-Ak注意,如果AA小于0.005,可将反应时间延长到5min。如果AA大于0.5,可将样本用提取液稀释后测定，计算公式中乘以相应稀释倍数。POD活性计算:用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、血清（浆）POD

4、活性单位定义：每m1血清（浆）在每m1反应体系中每分钟A470变化0.01为一个醉活力单位。计算公式：POD（Um1）=AAxV反总V样0.01T=2000AA2、组织、细菌或细胞PoD活性（1）按样本蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白在每m1反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。POD（U/mgprot）=AAxV反总子（V样XCPr）0.01T=2000ACpr（2）按样本鲜重计算单位定义：每g组织在每m1反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。POD（U/g鲜重）=AAXV反总（WxV样V样总）0.01T=2000AAW（3）按细菌或细胞密度计算单位定义：

5、每1万个细菌或细胞在每m1反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。POD（UI04ce11）=AAXV反总（500xV样V样总）0.01T=4AAV反总：反应体系总体积，0.2m1：V样：加入样本体积，0.01m1；V样总：加入提取液体积，1m1；T：反应时间，Imin；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量；500：细菌或细胞总数，500万。用96孔板测定的计算公式如下1、血清（浆）POD活性单位定义：每m1血清（浆）在每m1反应体系中每分钟A470变化0.005为一个酶活力单位。POD（Um1）=AAxV反总V样0.005T=4000A2、组织、细菌或细胞PoD活性

6、（1）按样本蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白在每m1反应体系中每分钟A470变化0.005为一个酶活力单位。POD（U/mgpro1）=AAXV反总（V样XCPr）0.005T=4000ACpr（2）按样本鲜重计算单位定义：每g组织在每m1反应体系中每分钟A470变化0.005为一个酶活力单位。POD（U/g鲜重）=AAXV反总（WxV样V样总）0.005T=4000AA+W（3）按细菌或细胞密度计算单位定义：每1万个细菌或细胞在每m1反应体系中卷分钟A470变化0.005为一个酶活力单位。POD（UZIO4Ce1I）=AAXV反总（500xV样V样总）0.005T=8AAV反总：反应体系总体积，0.2m1：V样：加入样本体积，0.01m1；V样总：加入提取液体枳，1m1；T：反应时间，Imin；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1：W：样本质量；500：细菌或细胞总数，500万。