过氧化氢含量H2O2试剂盒说明书.docx

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1、过氧化氢含（H2O2）试剂盒说明书微法IOO管/96样注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定渊定意义：出02是生物体内最常见的活性氧分子，主要由SOD和XOD等催化产生，由CAT和POD等催化降解。H2O2不仅是重要的活性氧之一，也是活性氧相互转化的枢纽。一方面，HWh可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体；另一方面H2O2也是许多氧化应急反应中的关键调节因子,。渊定原理：H2O2与硫酸钛生成黄色的过氧化钛复合物，在415nm有特征吸收。需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色

2、皿/96孔板、丙酮100m1、浓盐酸5m1、研钵和冰。试剂的组成和配制：试剂一：丙酮IOOm1X1瓶，4C保存：（自备）试剂二：粉剂X1瓶，4C保存：临用前加入3m1浓盐酸充分溶解备用。用不完的试剂4。C保存；（溶解时间较长，约30min,可4（C60C加热，务必提前准备）试剂三：液体IOm1x1瓶，4保存；试剂四：液体30In1X1瓶,4保存；H2O2提取：1、细菌或细胞样品的制备：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（IO4个）：试剂一体积（m1）为5001000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入Im1试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W,超

3、声3s,间隔10s,重复30次）；用试剂一定容至Im1；8000g4tC离心IOmin,取上清，置冰上待测。2.组织样品的制备：按照组织质量（g）：试剂一体积（m1）为1：510的比例（建议称取约S1g组织，加入Im1试剂一）进行冰浴匀浆：转移至EP管中，用试剂一定容至Im1,8000g4匕离心Iomin,取上清，置冰上待测。3、血清（浆）样品：直接枪测。渊定步事：1、分光光度计或衡标仪预热30min以上，调节波长至415nm,蒸储水调零。2、将试剂二、三和四37P（哺乳动物）或25C（其它物种）水浴IOmin以上。3、在EP管中按顺序加入卜.列试剂试剂名称（1）测定对照样本250试剂一250

4、试剂二2525试剂三50504000g,25离心IOmin,弃上清，留沉淀试剂四250250加入试剂四溶解沉淀后，室温静置5min,取2001转移至微量石英比色皿或96孔板中测定415nm处吸光值A。对照管只要做一次即可。计算A=A测定-A对照。注意事项；1、由于试剂一易挥发，试剂一必须先预冷再加，研磨时必须在冰上研磨。2、本试剂盒中试剂的挥发性较高，请带一次性手套和口罩。H2O2含量计算：a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、标准条件下测定的回归曲线，y=O.7488x+0.0006(X为标准品浓度，mo1m1;y为AA)。2、血清(浆)中H2O2含量的计算：H2O2含量(mo1m1)=

5、(A-0.0006)0.7488=1.34(A-0.0006)3、细菌、细胞或动物组织中H2O2含量计算(1)按照蛋白浓度计算H2O2含量(mo1mgprot)=(A-0.0006)O.7488V1(V1Cpr)=1.34(A-0.0006)Cpr需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。(2)按照样本质量计算H2O2含量(mo1g鲜重)=SA-0.0006)O.7488V1(WV1V2)=1.34(A-0.0006)W(3)按照细菌或细胞密度计算：H2O2含量(mo1104)=sa-0.0006)0.7488V11(500V1V2)=0.0027(A-0.0006)VI：加入反

6、应体系中样本体积，0.25m1；V2：加入提取液体积，1m1：Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。b.用96孔板测定的计算公式如下1、标准条件下测定的回归曲线，y=0.3744x+0.0006(X为标准品浓度，mo1m1;y为AA)。2、血清(浆)中H2O2含量的计算：H2O2含量(mo1m1)=(A-0.0006)0.3744=2.67(A-0.0006)3、细菌、细胞或组织中H2O2含量计算(1)按照蛋白浓度计算H2O2含量(mo1mgprot)=(A-0.0006)0.3744V1(V1Cpr)=2.67(A-0.0006)Cpr需要另

7、外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。(2)按照样本质量计算H2O2含量(mo1g鲜重)=(AA-0.0006)O.3744V1(WV1V2)=2.67(A-0.0006)W(3)按照细菌或细胞密度计算：H2O2含量(mo1104)=(AA-0.0006)0.3744V11(500V1V2)=0.0054(A-0.0006)VI：加入反应体系中样本体积，0.25m1；V2：加入提取液体积，1m1；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。注意：标曲线性范围为0.1mo1m1-2mo1m1,吸光度AA线性范围为0.03-1,若AA超过则需要稀释,计算公式乘以相应稀释倍数。