葡萄糖氧化酶glucoseoxidaseGOD试剂盒说明书.docx

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1、葡萄糖氧化酶（g1ucoseoxidase,GOD）试剂盒说明书微量法100管/48样注*:正式测定前取2-3个预期差异较大的样本做预测定澜定意义：GOD（EC1.1.3.4）广泛存在于动物、和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并产生H2O2,是生物体中产生活性氧的代谢途径之一。渊定原理：GOD催化产生H2O2,过氧化物酶催化H2O2氧化4-氨基安替比林偶联酚，生成有色化合物，在500nm有特征吸收峰，颜色深浅与GOD活性成线性关系。试验中所需的仪器和设备：可见分光光度计/酷标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、蒸储水试剂的组成和配制：提取液：液体IOO

2、m1XI瓶，4匕保存：缓冲液：液体30m1x1瓶，4X;保存；试剂一：粉剂X1瓶，20保存；临用前加入IOm1缓冲液充分溶解待用；用不完的试剂4*C保存一个月：试剂二：粉剂X1瓶，-20C保存；临用前加入IOm1缓冲液充分溶解待用；用不完的试剂4*C保存一个月：样品渊定的准备：1、细菌、细胞或组织样品的制备：细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（IO4个）：提取液体积（m1）为5001000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入Im1提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次）；8000g4C离心IOmi

3、n,取上清，置冰上待测。组织：按照组织质量（g）：提取液体积（m1）为1：570的比例（建议称取约0.1g组织，加入Im1提取液），进行冰浴匀浆。8000g4匕离心Iomin,取上清，置冰上待测。2、血清（浆）样品：直接检测。渊定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至500nm,蒸储水调零。2、试剂一和试剂二的配制：参见试剂的组成和配制。3、煮沸样本的准备：取2001样本至新的EP管中，95C水浴IOmin,冷却至室温后，8000g4离心IOmin,取上清作为对照管的煮沸样本待测。4、测定操作表试剂（1）对照管测定管样本50煮沸样本50试剂一7575试剂二7575混匀，35

4、C保温I5min后，于5()Onm波长处读取吸光度。AA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。GoD活力单位的计算，a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下回归方程为y=2.8348x-0.0169；X为H2O2标准品浓度(mo1m1),y为AA。1、血清(浆)GOD活力的计算单位定义：每m1血清(浆)每分钟催化产生InmO1H2。2为一个醒活力单位。GOD(nmo1/min/m1)=(A+0.0169)2.8348V反总V1T1000=58.8(A+0.0169)2、细菌、细胞或组织GoD活力的计算(1)按蛋白浓度计算单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生Inmo1H2。2为一个酶活

5、力单位。GOD(nmo1/min/mgprot)=(AA+0.0169)2.8348xV反总(V样XCPr)X1oo0T=58.8(A+0.0169)Cpr(2)按样本鲜重计算单位定义：每g组织每分钟催化产生Inmo1H2。2为一个酶活力单位。GOD(nmo1/min/g鲜重)=(AA+0.0169)2.8348xV反总(WxV样V样总)x1OOOT=58.8(A+0.0169)W(3)按细菌或细胞密度计算单位定义：每一万个细菌或细胞每分钟催化产生InmO1H2。2为一个酶活力单位。GOD(nmo1min104ce11)=(A+0.0169)2.8348V反总小(50OXV样V样总)1(XX)

6、T=0.118(A+0.0169)V反总：反应体系总体积，0.125m1：V样：加入样本体积，0.05m1：V样总：加入提取液体积，1m1；T：反应时间，】5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1：W：样本质量，g；5(X):细菌或细胞总数，5(X)万。1).用96孔板测定的计算公式如下回归方程为y=14I74x-0.0169；X为H2O2标准品浓度(mo1m1),y为AA。1、血清(浆)GOD活力的计算单位定义，每m1血清(浆)每分钟催化产生InmO1H2。2为一个酶活力单位。GOD(nmo1/min/m1)=(A+0.0169)!.4I74V反总V1TIOOO=118(A+0.0169

7、)2、细菌、细胞或组织GOD活力的计算(I)按蛋白浓度计算单位定义，每mg组织蛋白每分钟催化产生Inmo1FhCh为一个酶活力单位。GOD(nmo1/min/mgprot)=(AA+0.0169)14174xV反总(V样XCPr)X1oO()T=118(A+0.0169)Cpr(2)按样本鲜重计算单位定义：每g组织每分钟催化产生InmOIH2O2为一个酶活力单位。GOD(nmo1/min/g鲜重)=(A+0.0169)1.4174V反总(WxV样V样总)1()OOT=118(A+0.0169)W(3)按细菌或细胞密度计算单位定义：每一万个细菌或细胞每分钟催化产生InmO1H2。2为一个随活力单位。GOD(nmo1min104ce11)=(A+0.0169)1.4I74V反总(500xV样V样总)x1OOOT=0.235(A+0.0169)V反总：反应体系总体积，0.125m1：V样：加入样本体积，0.05m1：V样总：加入提取液体积，1m1；T：反应时间，15min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。