线粒体转氢酶-2TH-2试剂盒说明书.docx

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1、线粒体转氢酶2(TH-2)试剂盒说明书微法100管/96样注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定渊定意义：TH位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，傕化NADH+NADP和NAD+NADPH相互转化，倜节线粒体NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反应称为TH-2,催化NADPH和NAD*生成NADP+和NADHo漏定原理：NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3乙酰哦咤腺喋吟二核甘酸(APAD+)替代NAD+,TH-2催化APAD+还原生成APADH,APADH在375nm有特征光吸收，测定

2、375nm光吸收的增加速率，来计算TH-2活性。需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、Im1玻璃比色皿、研钵、冰和蒸饱水。试剂的组成和配制：试剂一：液体IOOm1X1瓶，-20C保存；试剂二：液体50m1x1瓶，-2OeC保存；试剂三：液体18m11瓶，4C保存；试剂四:粉剂X1支，20*C保存;试剂五:粉剂X1支，-20C保存；样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：准确称取Q1g组织或收集500万细胞，加入Im1试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。将匀浆600g,4离心5min.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g,4C离心IOmi

3、n。上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的TH-2(此步可选做)。步骤中的沉淀即为线粒体，加入500U1试剂二，超声波破碎(冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔10秒，重复30次)，用于TH-2活性测定。测定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至375nm,蒸饱水调零。2、样本测定(1)工作液的配制：临用前将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解，置于37(哺乳动物)或25(其它物种)水浴5min；用不完的试剂分装后-20保存，禁止反复冻融。(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入201样本和180H1工作液，混匀，立即记录375nm处初始吸光值A1和IOm

4、in后的吸光值A2,计算A=A2-A1.TH-2活性计算：a用微量石英比色皿测定的计算公式如下(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmo1APADH定义为一个酶活性单位。TH2活性(nmo1minmgpro)=AAV反总(d)x1()9(v样XCPr)T=149AACPr(2)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟产生1nmo1APADH定义为一个酶活性单位。TH-2活性(nmo1/minZg鲜重)=QAxV反总(d)x04(WxV样+V样总)T=74.5xAAW(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmo1APADH定义为一个酶活性单

5、位。TH-2活性(nmo1/min104ce11)=AAV反总(d)x1()9(500xV样V样总)=0.149AAV反总：反应体系总体积,21041；:APADH摩尔消光系数，6.71031mo1cm5d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02m1；V样总：加入提取液体积，0.5m1；T：反应时间，Iomin；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ni1：W：样本质量，g：500：细菌或细胞总数，500万。b.用96孔板测定的计算公式如下(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmo1APADH定义为一个所活性单位。TH2活性(nmo1/min/mgprot)=AAV

6、反总(d)x1()9(V样XCPr)T=298*AACpr(2)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟产生1nmo1APADH定义为一个酶活性单位。TH-2活性(nmo1/min/g鲜重)=AAW反总(d)乂此片(WXV样V样总)T=149xAA+W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmo1APADH定义为一个酶活性单位。TH-2活性(nmo1min104ce1D=AAV反总(d)109(500VVT=0.298AV反总:反应体系总体积，21041;:APADH摩尔消光系数，6.71031mo1/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02m1；V样总：加入提取液体积，0.5m1；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/m1：W：样本质量，g：500：细菌或细胞总数，500万。