线粒体复合体Ⅰ试剂盒说明书.docx

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1、线粒体复合体I试剂盒说明书微法IOO管/96祥注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定渊定意义：复合体I(EC1.6.5.3)又称NADHCoQ还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ,同时可使02还原生成O1是呼吸电子传递链上产生O?.一的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链(ETC)状态，而且可以反映活性氧(ROS)生成状态。浦定原理：复合体I能够催化NADH脱氢生成NAD+,在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。需自备的仪器和用品：紫外

2、分光光度计/断标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂的组成和配制：试剂一：液体Ioom1XI瓶，2(C保存；试剂二：液体20m1x1瓶，-20匕保存：试剂三：液体1.5m11瓶，20C保存；试剂四：液体25m1x1瓶，-20C保存：试剂五：液体Im1X1支，209保存；试剂六：粉剂X1支，2(TC保存，用时加入2m1蒸馆水；用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融。工作液的配制：临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解；用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融。样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：准确称取0.1g组织

3、或收集500万细胞，加入Im1试剂一和IOU1试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。将匀浆600g,4C离心5min。弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g,4C离心IOmin。上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体I(此步可选做)。步骤中的沉淀即为线粒体，加入200U1试剂二和2u1试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒，重复30次)，用于复合体I酶活性测定。浦定步骤：1、分光光度计或函标仪预热30min以上，调节波长至340nm,蒸储水调零。2、样本测定(1)工作液于37tC(哺乳动物)或25C(其它物种)孵育5min(2)在微量石英

4、比色皿或96孔板中加入Iou1样本、200U1工作液和15J1试剂六，混匀，记录34Onm处初始吸光值A1和2min后的吸光值A2,计克AA=AI-A2。复合体I活力单位的计算：冰使用微量石英比色皿漏定的计算公式如下：(1)按蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个醉活力单位。复合体I活力(nmo1/minmgproi)=AAV反总子(d)xWmv样XCPr)T=1808AACpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。(2)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。复合体I活力(nmo1/min/g鲜重)=QAxV反总SX

5、d)x104(WxV样V样总)T=365AAW(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。复合体I活力(nmo1/min/104ce11)=AV反总(d)x1()9(500xV样V样总)T=0.73AAV反总：反应体系总体积，2.251(T41;:NADH摩尔消光系数，6.221O31/mo1/cm：d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01m1；V样总：加入提取液体积，0.202m1；T：反应时间，2min；W：样本质量，g;500：细胞或细菌总数，500万。b使用96孔板渊定的计算公式如下：(1)按蛋白浓度计算单位的定

6、义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。复合体I活力(nmo1/min/mgproi)=AAV反总(d)x1()9+(V样XCPr)T=3616AACpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。(2)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。复合体I活力(nmo1/min/g鲜重)=AAV反总SXd)xW(WxV样V样总)T=730AA+W(3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmo1NADH定义为一个酶活力单位。复合体I活力(nmo1minIO4ce11)=&VV反总(d)x1()9(500xV样V样总)T=1.46AAV反总：反应体系总体积，2.251041；:NADH摩尔消光系数，6.221031/mo1/cm；d：96孔板光径,0.5cm；V样：加入样本体积，0.01m1；V样总：加入提取液体积，0.202m1；T：反应时间，2min：W：样本质量，g;500：细胞或细菌总数，500万。