药品清洁残留分析方法有关概念及影响因素.docx

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1、正文对于大多数药厂而言，共线生产的情况比较普遍，因此，药品生产质量管理规范（GoodManufacturingPractice,GMP）规定药品生产管理和质量控制的基本要求是最大限度地降低药品生产过程中污染、交叉污染以及混淆、差错等的风险1。生产后对设备的清洁作为防止污染和交叉污染的有效措施，需要用清洁验证来证实清洁方法的有效性。清洁验证历来是药品生产检查的重点，从近年的国际国内检查来看，也发现了不少问题，许多企业在清洁残留限度标准、部分设备未开展清洁验证、清洁方法和取样方法与回收率等多个方面存在不同程度的问题2。本文以清洁残留分析方法回收率的研究为切入点，查阅相关文献，对比归纳残留物分析方法

2、的有关概念和做法，研究影响分析方法同收率的各种因素。1相关概念对清洁后残留物分析方法的方法学考察，特别是对回收率的考察，关系到清洁是否彻底、清洁方法是否有效、清洁验证是否成功的关键。本文结合有关专著、文献的描述，GMP及有关附录中的规定，对涉及清洁验证分析方法的3组概念分别进行分析。其中2个1收率的概念关系本文主旨观点，笔者通过对法规描述的分析提出自己的观点一一将2个概念“合二为一”统一为“分析方法回收率”。笔者认为，之所以有2个不同的回收率概念，是因为对残留限度与可接受标准2个概念混淆不清，所以本文对这2个概念进行了分析，为提出统一的分析方法同收率概念提供支持。第3组概念“清洁对象与清洁参照

3、物”是分析方法的目标物,关系到分析方法的准确性即回收率研究的必要性，笔者结合有关文献的描述对此一并进行了分析比较。1.1取样方法回收率与检验方法回收率清洁验证中有2个回收率的概念，一为检验方法回收率，一为取样方法回收率。药品生产验证指南3中就有“方法的回收率可与取样的回收率结合进行”“取样回收率和检验方法回收率在内的综合回收率一般不低于50犷的描述。GMP1中对回收率的概念也有明确的要求，例如第一百四十三条“清洁验证应当综合考虑设备使用情况、所使用的清洁剂和消毒剂、取样方法和位置以及相应的回收率、残留物的性质和限度、残留物检验方法的灵敏度等因素”；GMP原料药附录4第二十四条“应当确定分析方法

4、可达到的回收率。”（原料药附录中的分析方法即检验方法。本文将分析方法与检验方法区分开。详见下文）。对检验方法来说，回收率表示测定的结果与真实值或参比值接近的程度，即准确度5；同理，对取样方法来说，回收率就是取样方法“取下来”的量与实际添加量接近的程度。对清洁验证时清洁残留的分析，一般认为检验方法回收率要先于取样方法回收率，因为取下来的量的多少要用一个可靠的检验方法来检测。检验方法通过验证后，方可进一步确定取样方法。得到取样方法同收率后，以残留限度与取样方法回收率的乘积作为可接受标准（在GMP1中，未明确残留限度与可接受标准的具体含义。本文将这两个概念区分开。详见下文），用来判断当前清洁方法对设

5、备生产后的清洁是否有效。1. 2残留限度与可接受标准GMP确认与验证附录6第八章清洁验证中有残留限度和可接受标准2个不同的概念，但未进一步说明。笔者认为残留限度应是经过评估分析计算得出的，清洁后允许残留在设备表面，对下批产品的生产不会造成安全性影响的最大值（单位面积下）；可接受标准是因为取样方法的局限性，即取样方法回收率，在实际取样后用来确定设备是否达到清洁标准的值。残留限度与可接受标准的区别，即上文所述的“残留限度X取样方法回收率二可接受标准”。因此，只有将残留限度和可接受标准区分开来，对取样回收率的研究才有意义；只有将取样方法回收率的结果计算进去，才能反映真实的残留情况7。这也正是单纯研究

6、检验方法回收率不完善的问题所在。1. 3清洁对象与清洁参照物GMP原料药附录4中有清洁对象和清洁参照物2个不同的概念，但未进一步说明。笔者认为，清洁对象是几个共线生产品种经过评估分析后，选定的活性或毒性较大的、溶解度较小的、相对更难清洁的产品；而清洁参照物则是清洁的主要对象，是清洁对象中的活性成分。对于原料药来说，清洁对象与清洁参照物在概念上是等价的，均是该原料药；对于制剂，则清洁对象是该制剂品种，而清洁参照物则是该品种所使用的原料药。在笔者查阅的文献中，绝大多数的研究者在模拟取样时使用清洁参照物为样品。例如王波等8在对复方氯噗沙宗片清洁后的擦拭回收率验证时，将复方中的氯噗沙宗和对乙酰氨基酚都

7、作为清洁参照物，均求得了擦拭回收率（分别是72.9%和93.5%）；只有柴振平等9和魏巍等10将清洁对象作为模拟取样时的试验样品。笔者认为，相比于原料药的清洁，制剂中所含的辅料是否影响活性成分的清洁效果，甚至是否影响清洁后擦拭取样的效果，这是值得探讨的。2文献分析通过对在中国知网检索到的2015-2023年的关于清洁验证残留物分析方法的21篇文献进行对比研究，发现主要分为3种情况：一是仅针对检验方法的同收率进行研究，未提及取样方法的回收率，共有2篇H-12；二是仅针对取样方法的回收率进行研究，未提及检验方法的回收率，共有14篇8-10,13-23；三是对2个回收率同时进行研究，共有5篇24-2

8、8。下面对以上3种情况进行具体分析。2. 1针对检验方法回收率进行的研究清洁验证检验方法的检测对象是生产后的清洁残留，从供试液浓度来说，相当于药品的杂质测定。杂质测定分两种情况，即定量分析和限度分析。其中，限度分析在方法验证时不需要对准确度即回收率试验进行考察5,但从清洁验证检验方法的研究来看，所有的研究者都是按照定量分析的验证要求来做的，不仅做了回收率试验，连同精密度、线性和范围等指标也一同进行了考察。在清洁验证回收率的研究中，只针对检验方法回收率进行研究的文献较少，仅有2篇文献。洪丽萍等用HP1C对非诺贝特缓释片生产清洁后的残留物非诺贝特进行了检验方法回收率研究；文中计算得出非诺贝特的残留

9、限度是0.059gcm-2,虽然文中提到模拟取样的面积为100cm2,但未对取样方法的回收率研究情况进行介绍。蔡亚兰等12用HP1C对硝酸益康噗乳膏生产清洁后的残留物硝酸益康噗进行了检验方法回收率研究；文中计算得出硝酸益康噗的残留限度是2.248gcm-2,虽然提到擦拭溶剂为乙醇，但同样未开展取样方法回收率的研究，直接设定取样回收率为100虬上述研究均是将相应生产品种的对照品溶液按照残留限度的要求稀释至相应浓度，再加入到相应浓度级别的对照品溶液中，作为供试品溶液，进行加样回收率试验。虽然参考药典“分析方法验证指导原则”5对检验方法的其他指标一并进行了验证，但由于未对模拟取样过程进行研究或介绍，

10、从清洁验证角度来说，未按GMP要求考虑取样方法的回收率，即清洁验证不充分。2. 2针对取样方法回收率进行的研究在整个清洁验证回收率的研究中，只针对取样方法回收率进行研究的文献占2/3o涉及的产品类型有片剂、注射液、栓剂、乳膏剂、原料药及中间体等。检验方法绝大多数是HP1a少数采用UV13-14,还有以PH和电导率为检测指标15。另外，总有机碳（ToC）也在清洁验证中有广泛应用，但因其是一种非专属性检验方法，本文未予讨论。取样方法回收率受取样的具体方法、取样人员的操作、取样工具的适用性等因素的影响。取样过程实际上是对药签、溶剂的选择，以及对取样人员的操作、残留物转移到药签、样品溶出（萃取）过程的

11、全面考察29o以下主要以擦拭法为例，分析模拟取样的整个过程中各因素对取样方法回收率的影响。2. 2.1取样的操作方法取样时绝大多数采用擦拭法，部分研究同时结合了淋洗法15-17,也有单独使用淋洗法13的。采用擦拭法，主要是因为能够对清洁后仍然粘附于设备表面的残留进行直接取样,与淋洗法相比更能反映设备的清洁状态。而淋洗法能够接触到不易直接擦拭的设备内表面，可作为擦拭法的补充方法。笔者认为，具体的取样方法不仅与设备型式有关（例如很长的管道），也与清洁前生产产品的性质、状况以及生产条件等因素有关。以一中间储罐或反应釜为例，清洁前生产的产品状态为液体，生产条件较为温和，如果是立即清洁，则完全可以采用淋

12、洗法取样；反之，对直接接触产品的零部件或模具较多的复杂设备而言，如果生产产品为固体颗粒，甚至是黏性较大的浸膏，则擦拭法是更为可取的取样方法。2. 2.2模拟取样平面的材质由于绝大多数的生产设备是不锈钢材质，所以擦拭法使用的材质基本上也是不锈钢的。有研究者对不同的设备材质分别进行了取样方法回收率的研究。贺佩兰17对搪瓷和不锈钢2种材质的平面进行了擦拭和淋洗回收率的研究，发现搪瓷的回收率要高于不锈钢；张振等口8则对4种不同材质（包括不锈钢、有机玻璃、钢化玻璃、聚四氟乙烯）平面的擦拭取样方法回收率进行了研究，结果显示有机玻璃最低，不锈钢最高；境外对我国企业的检查也曾提及密封胶圈的材质需要进行取样回收

13、率验证2。因此，清洁验证时要综合考虑产品在生产中接触到的各种材质，特别是容易处于清洁盲点的设备阀门、附属管道和零部件等。2. 2.3验证溶液的量与试验次数若选取的各生产设备各取样位置经擦拭后制得供试液中活性成分的量小于可接受标准（不是残留限度），说明使用的清洁方法对设备或设备链是有效的。取样方法回收率试验时，向模拟平面上添加的验证溶液的量应该就是残留限度的量。实际研究中，验证溶液的量一共有2种方式：一是只有一种数值；二是围绕残留限度有3个不同梯度的量，将残留限度包括在这个梯度范围内（中间梯度即是残留限度）。从2017-2018年的国内检查来看，就有诸如“取样回收率验证溶液浓度不在可接受范围内”

14、2的问题。如同检验方法回收率试验一样，取样方法回收率也要多次试验。但多数研究者未采用药典检验方法回收率的设计方式。无论验证溶液的量如何设定，取样方法同收率的试验次数和方式多种多样,有的只进行1组试验,试验次数有319、620、921次的；有的设计3组试验，每组有39-10,13,16-18、622-23次的。因此，总的试验次数相差较大，从3次到18次都有。但笔者考虑，如果上述2种方式（16,3X3）,与药典“分析方法验证指导原则”5中对回收率试验的次数要求是相同的，既可以同一浓度测定6次，也可以3种不同浓度分别测定3次。2. 2.4具体操作过程（涂布、干燥、擦拭与转溶）1）模拟取样面积、验证溶

15、液的体积与涂布方式所查文献中模拟取样的面积基本分为2种情况，一种是IOxIOCm2,一种是5X5cm2o各研究者没有对此作出说明，笔者认为取样面积应与实际生产设备的体量有关，大型生产设备的取样面积宜取较大值，这样比较有代表性。另外，还与验证溶液的体积有关，如果取样面积大而验证溶液体积小，溶液在整个平面上分布不均匀。有的文献9,18,22-23中溶液体积很小，仅为0.1m1,如何精确地将如此少量的溶液均匀地涂布在相对较大的面积上，操作起来相对比较困难。对于溶液如何在取样平面上均匀地分布，各研究者都没有详细描述，均以一种涂布方法简略而过，有的是“涂”10,16,19-20,有的是“滴”18,22-

16、23或“点”9,有的是“注”21,有的是“倾倒”17。笔者建议可以采取下列方法：以5义5cm2的取样面积，验证溶液体积1m1为例，1Ii11在常温下约为20滴（每cm2约1滴），可用矩阵点加法，使用定量移液枪逐滴点到平板上，利用液滴的重力和在平面的张力自然摊开。2）验证溶液的干燥方式溶液干燥后才能取样。干燥方式有自然晾（风/挥）干9,14,18,21,23、电吹风吹干20,22和烘干19。笔者认为，采用何种干燥方式应与实际清洁后设备的干燥方式有关。若设备清洁后没有干燥操作的，可选自然晾干；若采用压缩空气吹干的，可选电吹风吹干（注意风速）；加热或利用余热干燥的，可用烘干。此外，干燥方式与取样方法回收率也有一定关系，不同程度的干燥方式使残留物质与