DB22T-实验用兔人工繁育技术规程.docx

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1、ICSDB2?吉林省地方标准DB22实验用兔冷冻精液人工授精技术人工繁殖带格式的：图案：10%（自动设置前景,飞色背薪技术规程JeChniCa1ProCedUreforartificia1inseminationOffrozenSemeninIabOratOryrabbitszFeeH-eaj-Feg-H-1aGisk)Aa-fia-1-bFeedgOfexperi-Hentab栩XXXX-XX-XX发布,XXXX-,XX-.XX实施吉林省市场监督管理厅域代码已更改域停码已更安域代码已更改域代码已更改域代码已更改（带格式的：字体：TimeSNewRoman本文件按照GB/T1.1-2023标准

2、化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则和GB/T2000142015给出的规定起草。本文件由吉林省科学技术厅提出并归口。本文件起草单位：吉林大学。本文件主要起草人：高安崇、权福实、1陈健、1袁宝、1梁爽、1王大力J1干秀娜Tm,实验用兔实验兔人工繁殖冷冻精液人工授精技术规程1范围本文件规定了实验用兔冷冻精液人工授精过程中的输精准备、精液准备、冷冻精液、输精、标识和档案管理。本文件适用于实验用兔的冷冻精液人工授精繁殖。2规范引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所

3、有的修改单）适用于本文件。GB149252010实验动物环境及设施GB/T35823-W实验动物动物实验通用要求NY/T3185-家兔人工授精技术规程NY1181输精细管DB22/T27382017梅花鹿细管冻精人工授精技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1坡验用兔IaboratoryeXPerimenta1rabbits（带格式的：字体：TimeSNeWROman）经人工饲育，对其携带的微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究教学、生产、检定以及其他科学实验过程中使用的实脸用兔家兔。3.2A平衡equi1ibrium（带格式的：字体：TinIeSNeWR

4、e）Inan）在家畜精液冷冻保存中，精液经稀释后缓慢降温至45。，并在此环境中放置一定时间一定时间以增强精子的耐冻性，这个处理过程叫做平衡。3.3台兔dummyrabbit（带格式的：字体：Tin1eSNeWROman）用于诱导种公兔爬跨的发情母兔。、（带格式的：缩进：首行缩进：2字符4输精准备41输精场地输精场地应符合GB149252010的要求/,441种公兔选择批注11:规定和要求二者选一个就行带格式的：字体：TimesNewRoman种公兔质量应符合GB/T35823-2018中第7章规定的要求种公兔应符合GB/T358232018的要求,且-1(带格式的：字体：TinIeSNeWRO

5、Inan)体质结实健康,生产性能优秀，生殖器发育正常，性欲旺盛,精液品质优秀，系谱明确日族无遗传疾442种公兔调教采精前30d加强营养，将成年发情母兔放入公兔笼内，让公兔爬跨母兔34次，每周23次，每次不超过IOmin为宜。与J43清洗包皮,使用占有09%生理盐水的纱布擦拭公兔外生殖器，并清理外生殖器周边污秽黏着物。按照NM.带格式的：字体：TimeSNeWRonI/一31852018的要求进行4-54.4母兔选择台兔和输精母兔的质量应符合GB/T35823-2018.中第7章规定的要求.，台兔一般选择性格温顺且在发情期的母兔，输精母兔选择非妊娠期和哺乳期的能繁母兔。台兔和输精母兔的选择应符合

6、GB/T358232018及NY/T31852018的要求。用“4.5设备与器具4.56.1药品与器械根据需要准备相关的器械药品，参见附录A。462器具清洗和消毒按照DB22/T27382017的要求进行U4.56.窕_假阴道的准备按照NY/T3185-2018的要求进行。4直6.包稀释液配置才宁檬酸钠038r,无水葡萄糖4.5r,力口蒸储水至IOOm1按Tris30.3g1,柠檬酸16.8g1,葡萄糖12.5gV/1配制好基础液,消毒灭菌后置5-冰箱中保存备用。采精前取出基础液，分别加入卵黄20m1,青霉素、链霉素各10万U,以卵黄(20Om1/1)，青霉素(1.0X106j1),链霉素(1

7、.0XIOu/1)及8%带格式的：字体：TimeSNewRoman带格式的：字体颜色：自动设厂I带格式的：字体：TiineSNeWROman)带格式的：字体颜色：自动设置)I带格式的：字体：Tin1eSNeWROman)带格式的：字体：TimeSNeWROInan)(带格式的：字体：Tin1eSNeWROman)的甘油，混匀后预热至30用于稀释品质合格的精液。匚精液准备5J,精液的采集带格式的：字体颜色：自动设置J一只手抓住台兔的双耳和后颈皮,另一只后握住假阴道,将假阴道放置台兔双后腿之间靠近外阴处,臀部朝内慢慢将台兔送进公兔笼内，再调整假阴道角度，使其与水平呈30角，待公兔爬跨台兔时，立刻将

8、假阴道套入公兔阴茎，当公兔用力向前一挺，之后侧倒并不断抽搐时，代表已经射精完毕，可以籽台兔放开，并竖立假阴道，让精液流入集精瓶中，集精瓶要及时做好标识。52精液质量的检测精液质量的检测，参见附录B.1-B.3。53精液的稀释将稀释液预热到2530,用移液器将稀释液沿试管壁缓慢注入精液中，再用玻璃棒轻轻搅动混合物，使其混匀；根据精液质量决定稀释倍数，一般稀释59倍。精液的采集、稀释、检测和保存应按照NY/T31852018的要求进行U流精瓶要及时做好标识5口冷冻精液1精液冷冻与保存将稀释后的精液，用至少16层以上以上脱脂纱布包裹,置于放上5冰箱中缓慢降温平衡60min,一平衡后使用Im1注射器抽

9、取，再缓慢注入025m1的输精细管中，卦口封死输精细管后左手距离距液氮表面3zm处熏蒸8min,立即将其移至放入液氮罐中冷冻保存。冷冻精液应保存在液氮罐，包装物应完全没入在液氮中。X62精液解冻将从液氮罐中取出所需的输精细管立即放入40。恒温水浴锅中，约3秒后取出，用细管剪剪去封口端，用细管推针将同一只公兔的精液全部注入到集精瓶中，立即检查精液品质。解冻后精液品质的检测解冻后精液品质的检测，参见附录B。5冷冻精液的保存冷冻精液应保存在液氮罐，包装物应完仝没入在液氮中UQ-1输精按照NY/T3185-2018的要求进行输精。78标识集精瓶和输精细管标识符合附录C的规定，包装物标识清晰。一（带格式

10、的：字体：TimeSNeWRoman（带格式的：字体：TimeSNeWROman带格式的：首行缩进：0字符带格式的：字体颜色：自动设置带格式的：字体：TimesNewRoman带格式的：字体：TimeSNeWROman）82_档案管理做好配种记录，并长期保存，配种记录表参见附录D。I-带格式的：两端对齐附录A（资料性附录）人工繁殖授精器材药品人工繁殖授精器材药品见表A.1o表A.1人工繁殖授精器材药品表品名单位数量品名单位数量蒸汽消毒锅台1酒精灯个1恒温水浴锅台1医用凡士林瓶1干燥箱台1集精瓶瓶适量640倍生物显微镜台1一次性乳胶手套副适量盖玻片、载玻片片适量促黄体素释放激素A3盒适量擦镜纸本

11、1温度计支1301液氮罐个1实验室计数器个1冰箱台1移液器支适量恒温箱台1甘油瓶1细管个适量果糖瓶1Im1注射器支适量伊红试剂瓶1细管镣子把1青霉素支1细管剪把1链霉素支1细管推针支适量鸡蛋个2输精枪把1消毒脱脂纱布磅1采精器个3葡萄糖瓶1采精器内胎个6柠檬酸钠瓶1输精管个适量瓶4柠楼酪钠瓶工注：其它常用必备物品有蒸储水、75%酒精、2%碘酊、福尔马林、生理盐水、标签、药匙、纸巾、桌椅等。输精细管的外观应符合NY1181要求，规格为0.25m1。附录B带格式的：字体：TimeSNeWROman）（资料性附录）解冻后精液品质的检测（带格式的：字体：TimeSNeWROman）B.1精子活力采用“

12、十分制”进行计数，视野中精子直线运动率为率0%记为活力值为1.0,90%记活力值为0.9,依次往下类推，常温精子活力值应在06以上，解冻后精子活力应在0.3以上。按照NY/T31852018的要求进行UB.2精子畸形率B.2.1方法带格式的：字体：TimeSNewRoman用移液器吸取充分混合后的解冻精液51,与51伊红试剂于预热好的载玻片上均匀混合，在载玻片的样本上使用移液器头进行搅拌以确保混合均匀。使用盖玻片加以覆盖，待反应30s后，用640倍光学显微镜检验制备的样本玻片；使用实验室计数器对染色即畸形精子与总精子数量进行计数。B.2.2计算每次计数200个精子，每个样品观察两个相邻的计数室

13、，取平均值；如果两个计数室误差超过5%,则应重新检测。计算公式：畸形率=畸形精子数/计数精子总数X100%。采用精子畸形率W20%的精液。B.3精子质膜完整率8.3.1 低渗透溶液的制备采用0.735g的柠檬酸钠及1.351g的果糖溶于IOOm1的蒸储水中，其离子浓度为0.15,渗透压为150mOsm/1o8.3.2 低渗膨胀实验方法采用移液器吸取充分混合后的解冻精液1001于离心管中，加入Im1低渗液，然后将其混匀置入37恒温箱中孵育1鼠用移液器吸取101混合液与载玻片上，盖上盖玻片，置于640倍显微镜下观察。采取实验室计数器对未膨胀即死亡与总精子数量进行计数。8.3.3 精子形态在低渗溶液

14、中精子可存在以下形态：a型：未膨胀精子；b型：尾尖膨胀；C型：尾尖弯曲膨胀；d型：尾尖膨胀伴弯曲膨胀；e：尾弯曲膨胀；f：尾粗短膨胀；g：尾整体膨胀。8.3.4 计算每次计数200个精子，每个样品观察两个相邻的计数室，取平均值；如果两个计数室误差超过5%,则应重新检测。计算公式：精子质膜完整率二g形精子数/计数精子总数X100%。采用精子质膜完整率三42%的精液。附录C（资料性附录）实验用兔实验兔冷冻精液标识C1集精瓶标识表C1集精瓶标识公兔耳号采精时间精液量稀释倍数精子活力C.2细管标识乡田管标识包括生产日期和公兔耳号两部分。按以下排布:（带格式的：字体：TimeSNeWROman）（带格式的：字体：TimeSNeWROman）棉塞封口端生产日期公兔耳号w附录D带格式的：字体：TimeSNewRoman