DB52T-贵州地方鸡资源场禽白血病净化技术规范编制说明.docx

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1、贵州地方鸡核心种群禽白血病净化技术规程编制说明1刖另种源感染垂直传播是禽白血病(A1)的主要流行途径，以蛋鸡、肉鸡感染为主，其危害主要表现为鸡高度的免疫抑制和皮肤血管瘤、脏器肿瘤导致种鸡死淘率过高、生产性能下降等，已成为当前鸡新城疫、禽流感“免疫再现”的主要流行病学因素，并逐步向地方鸡种群蔓延，致使鸡种群疫病净化工作一度在国内倍受关注。据2009年流行病学调查结果显示，贵州地区禽白血病Ab亚群感染阳性率为14.65%,J亚群感染阳性率为24.86%oA1V是一种基因组为单股RNA病毒，可分为A、B、C、D、E、F、G、H、I和J十个亚群,但自然感染鸡群的主要有A、B、C、D、E和J六个亚群，与

2、其他病毒不同的最大特点是可分为外源性A1V和内源性A1V两大类，其中内源性A1V都属于E亚群，通常没有致病性；A1V-J亚型和Ab亚型是我国目前主要的致病性外源性病毒，致病性和传染性最强。与A1V诊断和预防控制相关的抗原蛋白主要有两个，囊膜糖蛋白gp85和衣壳蛋白p27,其中gp85是区别不同亚群的抗原，p27是群特异性抗原，该蛋白在不同亚群间无明显区别。不论外源性病毒和“E”亚群内源性病毒，在感染细胞后都可产生p27抗原，只是在表达量上可能有所不同，因此，A1VP27抗原阳性监测是鸡群感染与否的重要指标。黔东南小香鸡、赤水竹香乌骨鸡、乌蒙乌鸡、瑶鸡、长顺绿壳蛋鸡、威宁鸡、兴义矮脚鸡等都是贵州

3、地区重要的特色禽品种优势种质资源，对推动贵州生态家禽产业的发展发挥着重要的作用。生态家禽是贵州山地高效特色农业发展中重点推进的十二个扶贫产业之一，为加强对贵州地方鸡种群资源的保护和有效开发利用工作，以黔东南小香鸡核心种群禽白血病净化技术集成应用示范为基础，特制定贵州地方鸡核心种群禽白血病净化技术规程。一、任务的由来本标准由贵州省农业农村厅提出，由贵州省市场监管局关于下达2019年贵州省第二批地方标准制修订项目计划的通知黔市监标函201947号批准立项，编号2019-43。二、本标准的主要起草单位及人员贵州地方鸡核心种群禽白血病净化技术规程主要起草单位及人员一览表主要起草单位主要起草人员职称任务

4、分工贵州省畜牧兽医研究所文正常研究员标准起草贵州省畜牧兽医研究所王璇副研究员标准起草贵州省畜牧兽医研究所唐继高高级畜牧师标准起草贵州省畜禽资源管理站张芸推广研究员实地调查贵州省畜牧兽医研究所潘淑惠研究员实地调查榕江县农业农村局王永春、高级畜牧师试验开展贵州省畜牧兽医研究所张杨子研究实习员试验开展贵州省畜牧兽医研究所冉江研究实习员试验开展榕江县农业农村局姜兆芳助理兽医师试验开展贵州省畜禽资源管理站黎恒铭畜牧师试验开展贵州省畜禽资源管理站沈德林高级畜牧师实地调查贵州省榕江山农发展有限责在公司陈亚亚技术员试验开展贵州省畜牧兽医研究所吴均彤高级兽医师试验开展开阳县农业农村局明炜助理畜牧师实地调查三、本

5、标准起草过程本标准的研究及编制期限为2019年6月2023年6月，期限26个月，分3个阶段开展：(1)资料收集阶段2019年6月2019年8月，组建标准起草小组，收集标准编制的背景材料和有关标准编制的参考、引用资料，进行归纳整理。(2)实地调研阶段2019年9月2023年10月，分别对贵州小香鸡养殖生产的区域进行考察及对小香鸡禽白血病净化技术的相关指标进行收集和统计。(3)综合分析、论证和标准编写阶段2023年月2023年12月，为保证参数可靠、准确，起草小组对所获资料和数据进行审核和统计分析，并参照相关参考文献，按照GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写的要求，形成

6、贵州地方鸡核心种群禽白血病净化技术规程讨论稿。(4)征求意见阶段2023年4月，向社会各界征求意见。(5)审定阶段2023年7月，组织相关专家对本标准进行审定，进一步修改完善，形成标准报批稿。四、标准编制原则1.编制原则（1）准确性坚持科学的原则，标准的内容均来源科学研究和生产实践，所规定的条款力求明确而无歧义。（2）统一性标准结构、文体和术语力求统一。本标准在编制过程中涉及其结构、编写规则和内容按照GB/11-2000标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写规则和GB/T1.2-2002标准化工作导则第2部分:标准中规范性技术要素内容的确定方法执行。（3）协调性充分结合现有基础标准的有关条款

7、,达到标准间的相互协调。（4）适用性标准内容易于实施，便于被其它文件所引用且具可操作性。（5）特殊性本标准既遵循相关国家标准和地方标准的要求，其内容以贵州地方鸡种群资源和自然条件为基础，为贵州生态家禽产业发展提供技术支撑与服务，并注重实用性和可操作性。2.编制依据目前，GB/T36873-2018原种鸡群禽白血病净化检测规程是参照GB/T26436-2010禽白血病诊断技术方法，即采集核心群鸡新鲜血浆接种DFT细胞,感染维持9d后检测细胞培养物中的p27抗原，淘汰p27抗原检测结果为阳性的鸡只，分别在68日龄和168日龄以同样的方法做两次采血接种，检测p27抗原；对留种核心群的下一代刚出壳的雏

8、鸡收集胎粪，检测胎粪中的p27抗原，将阳性鸡的所有家系成员淘汰，如此反复，经45个世代，直至达到净化，但净化成本及对净化的条件要求较高。本标准在参照国家标准的基础上，结合我省地方鸡资源和产业发展现状以及地方鸡保种企业的基础条件、资金投入、技术平台等实际，应用禽白血病病毒抗原快速交叉检测方法检测P27抗原，淘汰阳性鸡只。内容紧密结合实际，具有科学性、规范性和可操作性。五、标准王要内容本标准规定了贵州地方鸡核心种群禽白血净化的鸡群养殖环境条件及要求、检测条件、净化流程与方法、种蛋选留与孵化、净化效果与评估、无害化处理和养殖档案记录等。本标准适用于贵州地方鸡资源场。六、主要验证分析和预期效果1净化鸡

9、群养殖环境条件及要求11对净化目标种群进行单独分区隔离饲养，要远离其他鸡群，避免其他鸡群交叉感染1.2建立并严格执行鸡场卫生管理制度，加强环境消毒。用聚维铜碘、戊二醛、氯制剂等畜禽专用消毒剂对在鸡场内外环境定期进行消毒，每周坚持消毒2次以上。13对净化种群配备专职管理人员，控制除专职技术员、饲养员等以外人员出入鸡场。1.4 资源净化场养殖环境空气质量符合GB3095标准；饲料卫生符合GB13078标准；饮用水水质符合NY5027标准；场环境质量符合NY/T388标准；兽药使用要求执行国家农业农村部兽药管理条例(2023年国务院令第726号)。1.5 对净化鸡群使用弱毒疫苗的质量规范应符合国家农

10、业农村部兽药管理条例(2023年国务院令第726号)要求，做到疫苗无外源性禽白血病病毒污染,购买疫苗时向生物制品生产或经营企业索取该批次产品的检测报告并保留疫苗样品备查。16每天及时清除粪便，并对粪便做无害化处理。2、检测试验条件试验检测在贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室开展，分析实验室用水规则和试验方法符合GB/6682规定。3、试验检测使用的主要试剂及仪器设备3.1主要试剂:IDEXX禽白血病抗原E1ISA检测试剂盒(Avian1eukosisVirusAntigenTestKit)禽白血病病毒抗原胶体金快速检测试纸条、Go1dViewI型核酸染色剂、D120002TaqPCRMaste

11、rMix(0.05U1)、TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒、Tris、EDTA等、动物组织基因组DNA提取试剂盒(Universa1GenomicDNAExtractionKit)等。3.2主要仪器：Mu1tiskanFC全自动酶标仪、微量移液器、HETTICH台式高速冷冻离心机、紫外可见分光光度计(TU-1800SPC)、梯度PCR仪，核酸电泳系统与凝胶成像分析系统、DYCP-31DN型电泳仪等。4、试验方法4.1 净化流程4.1.1 根据资源场种群规模，选定一定数量的拟净化核心基础种群，待对净化种鸡群完成生产和繁育性能测定后，采集每只鸡的血清和泄殖腔棉拭子并标记，用禽白血病

12、抗原E1ISA检测试剂盒和胶体金快速检测试纸条进行A1Vp27抗原交叉检测。淘汰阳性鸡，阴性种鸡人工授精后收集种蛋孵化。4.1.2 2对阴性种鸡繁育的第一世代1日龄雏鸡（出壳24小时以内）全部采集胎粪并标记，用禽白血病抗原E1ISA检测试剂盒和胶体金快速检测试纸条进行A1Vp27抗原交叉检测，按全同胞淘汰阳性雏鸡及其对应的种母鸡，阴性雏鸡按全同胞上笼育雏和育成。4.1.3 在22周龄23周龄开产初期，全群采集鸡血清和泄殖腔棉拭子，同时每只母鸡取2枚蛋取蛋清，用禽白血病抗原E1ISA检测试剂盒和胶体金快速检测试纸条进行A1Vp27抗原交叉检测；公鸡采集精液用PCR方法进行A1Vp27抗原检测。淘

13、汰阳性鸡。4.1.4 14在留种前的第28周龄30周龄，全群采集鸡泄殖腔棉拭子，同时每只母鸡取2枚种蛋的蛋清，用禽白血病抗原E1ISA检测试剂盒和胶体金快速检测试纸条进行A1Vp27抗原交叉检测；采集公鸡精液用PCR方法进行A1Vp27抗原检测。淘汰阳性鸡，留阴性种鸡进行人工授精，收集种蛋进行孵化。4.1.5在完成第一世代的禽白血病检测与净化后，对23个世代次的鸡群禽白血病检测与净化从1日龄雏鸡开始，重复4.1.24.1.4操作步骤。4.2样品采集与处理4.2.1无菌采集鸡泄殖腔棉拭子加入In11样品稀释液后，在-70。C下反复冻融3次待检。4.2.2鸡翅静脉无菌采，用离心机提取血清样品用于检

14、测。4.2.3每只种母鸡收集12枚种蛋，每枚种蛋吸取Im1蛋清于1.5m1离心管中，-20。C反复冻融3次后用于检测。4.2.4将种公鸡泄殖腔周围用酒精棉球擦拭干净，轻轻按摩其腹部至尾部，待泄殖腔外翻时，轻轻挤压泄殖腔外缘，将精液接入装有Im1稀释液（含青链霉素的灭菌PBS）的灭菌离心管中，混匀后，离心取上清液用于检测。4.2.5当天收集出壳雏鸡胎粪，用灭菌指形管按鸡只个体分别收集样品，加入Im1的样品稀释液，轻轻挤压雏鸡的腹部，排出胎粪，装进样品管中，准备洁净小棒，搅动指形管里胎粪，待混匀后放入-70。C冻存2h,再将样品取出于室温融化，如此反复冻融3次后吸取上清用于检测。4.3检测净化技术

15、4.3.1禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法符合NY/T680要求，禽白血病抗原E11SA检测试剂盒(Avian1eukosisVirusAntigenTestKit)由美国IDEXX工作生产。4.3.2禽白血病病毒p27抗原PCR特异性检测方法符合GB/T26436要求(禽白血病诊断技术)。4.3.3禽白血病病毒抗原快速检测试纸条购自北京纳百生物科技有限公司，操作方法按说明书进行。4.4净化检测要求4. 4.1对用禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验和胶体金试纸条检测方法进行交叉检测时，如同一检测样本鸡的血清、泄殖腔棉拭子或蛋清出现阴性和阳性结果差异，只要其中一种检测方法及样本检测结果呈阳性，要对阳性鸡做淘汰处理。5. 4.2在淘汰阳性鸡的同时，要加强对鸡群的观察，密切监视鸡群状态，对有疑似临床症状的病鸡及已死亡鸡要及时淘汰，并进行无害化处理。5试验检测技术操作步骤6. 1E11SA检测步骤将待检样品编号，分别加入酶标板微孔中，每孔1001,同时在酶标板上适当位置分别加入阳性对照和阴性对照，每孔1001,置1826孵育60min.孵育完毕甩掉板中液体，在吸水纸上拍干，每孔加蒸储水或去离子水35