维生素B6VitaminB6VB6试剂盒说明书.docx

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1、维生素B6（VitaminB6,VB6）试剂盒说明书微法1OOT/96S注意:正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。测定意义：维生素B6（VitaminB6）又称毗哆素，其包括毗哆醉、毗哆醛及毗哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生：素，在细胞中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢，对生物体具有极其重要的作用。测定原理：VB6与4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在390nm有特征吸收峰。自备实验用品及仪器：天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、蒸储水。试剂组成和配制:提取液：液体70m11瓶，4保存。试剂一：液体Im1

2、X1瓶，4*C保存。试剂二：液体5m11瓶，4C保存。试剂三：液体8m11瓶，4C避光保存。试剂四：液体8m1X1瓶，4C避光保存。样本处理I1 .组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积（m1）为1510的比例（建议称取约O1g,加入0.6m1提取液）加入提取液，60C浸提30min,加蒸储水0.4m1,混匀后于25,1600OrPm离心IOmin,取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30分钟）。2 .细胞：按照细胞数量（IO4个）：提取液体枳（m1）为5001000:1的比例（建议500万细胞加入0.6m1提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒

3、，总时间3min）：加蒸储水0.4m1,混匀后于25C,1600OrPm离心IOmin,取上清测定。3 .血清：直接测定。测定操作I空白管测定管样品（U1）40试剂一（H1）40试剂二（1）4040试剂三（1）6060试剂四（H1）6060充分混匀，25C反应20min,于微量石英比色皿杓6孔板，测定39Onm处吸光值，记为A空白管和A测定管，4A=A测定管-A空白管。空白管只要做一管。计算公式，a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线：y=0.3635x+0.0205,R2=0.99861 .按照蛋白含量计算VB6含量(gmgprot)=(A-0.0205)0.3635xV反总(V样X

4、CPr)=13.76(A-0.0205)Cpr2 .按照样本质量计算VB6含量(gg)=(A-0.0205)0.3635V反总(V样WV样总)=13.76(A-0.0205)W3 .按照细胞数量计算VB6含量(g104ce11)=(A-0.0205)0.3635xV反总(V样X细胞数量V样总)=13.76(A-0.0205)细胞数量4 .按照液体体积计算VB6含量(gm1)=(A-0.0205)0.3635V反总V样=13.76(A-0.0205)V反总：反应总体积，0.2m1；：V样：加入样本体积，0.04m1；V样总：加入提取液体积，1m1：Cpr：蛋白浓度，mg/m1；W：样本质量，gb

5、.用96孔板测定的计算公式如下标准曲线：y=0.1818x+0.0205,R2=0.99861 .按照蛋白含量计算VB6含量(gmgprot)=(A-0.0205)+0.1818xV反总(V样XCPr)=27.52(A-0.0205)Cpr2 .按照样本质量计算VB6含量(gg)=(A-0.0205)0.1818xV反总(V样WV样总)=27.52(A-0.0205)W3 .按照细胞数量计算VB6含量(g104ce11)=(A-0.0205)0.1818V反总(V样X细胞数量V样总)=27.52(A-0.0205)细胞数量4 .按照液体体积计算VB6含量(gm1)=(A-0.0205)0.1818V反总V样=27.52(A-0.0205)V反总：反应总体积，0.2m1：V样：加入样本体积，0.04m1；V样总：加入提取液体积，1m1：Cpr：蛋白浓度，mg/m1；W：样本质量，g注意事项1 .若测定结果中吸光值超过1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。2 .蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定，在计算公式中乘以稀释倍数。3 .显色完成后立即进行测定。