新冠核酸检测扩增检测操作规程(金豪).docx

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1、S0P_18-36 新型冠状病毒2019-nCoV基因（金豪）扩增检测操作规程1 .名称新型冠状病毒（2019-nCoV） RNA2 .目的规范新型冠状病毒（2019-nCoV） RNA荧光定性PCR项目检测试验，确保检测结果的准确性和重复性。3 .方法TaqMan探针实时荧光定性。4 .检测原理根据荧光PCR技术原理，针对2019-nCoV目的基因0RFlab与N基因设计特异性引物和Taqman探针，通过荧光PCR检测仪进行检测，从而实现对2019-nCoV的定性检测。试剂盒以正常人上皮细胞中广泛存在的核糖核酸酶P （RNase P, RP）的mRNA为正常人体细胞对照，对提取和检测过程进行

2、监控。5 .样品咽拭子、痰液等6 .试剂北京金豪制药股份有限公司，新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（荧光PCR法）成分规格48T数量主要成分2019-nCoVORFlab/N反应液0. 9mL管1管含 dNTPs、MgC12、2019-nCoV 的 ORFlab/N 基因及RNP特异性PCR引物和荧光探针的混合液酶混合液100ul管1管逆转录酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制剂阴性对照1. 0mL 管1管无核酸水阳性对照200ul管1管含ORFlab基因、N基因、RNP的假病毒混合物7 .仪器苏州雅睿生物技术有限公司MA-6000实时荧光定量PCR仪。8 .操作步骤9 . 1 PCR试

3、剂准备（I区）8. 1. 1从试剂盒中取出2019-nCoV ORFlab/N反应液、酶混合液，室温融化后振荡混匀，掌上离心机离心10秒后使用。8. 1. 2取N个（N=待测样本个数十阴性对照品+阳性对照品）PCR反应管将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将20ul扩增体系分装到PCR管中。将装有PCR反应液的PCR管置I区II区传递窗，传递至标本制备室，如不能尽快使用，可暂放与4度冰箱冷藏，2小时内用完。NC单人份扩增体系配制如下表:PCR检测混合液RT-PCR 酶扩增体系18ul2ul20ul8. L 3试剂准备区清洁:每次完成配液操作后，用75%的酒精清洁

4、实验室台面，用2000mgL含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。8. 2核酸模板提取（II区）核酸提取:取200ul液态样本进行核酸提取。采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取或纯化试剂盒陕西械备20140007号；具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。8. 3加样（H区）在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性对照品、待测标本核酸、阳性对照品各5ul,盖紧管盖，8,000rpm离心数秒后，置区I区传递窗。标本制备区清洁：每次完成试验操作后，医疗垃圾用2000mgL含氯消毒剂喷洒至完全湿润，用鹅颈式封扎，带出二区高压处理后按规范处置。用75%的酒精清洁实验室台

5、而，用2000mgL含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。8.4 PCR扩增检测（HI区）8. 4. 1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。8. 4. 2循环参数设定：步骤反应温度时间是否采集荧光循环数逆转录及变性5030分钟否1嗔八七小发出报告，应分析原因，必要时重新检测样本。10.2每次试应应设置阳性对照和阴性对照，且符合以下要求，否则试验结果不成立。10.2.1 阴性对照:无Q值。10.2.2 阳性对照：CT值小于33.0。10.2.3 内参:小于等于38.0。1L结果分析11.1阳性判断见下表阳性值结果判断结果判断阳性结果判断CT值阴性无CT值阳性0C

6、T38.()灰区38.0CT40.011.2样本孔结果判读模式如下:FAM通道(ORFlab)HEX通道（N基因）ROX通道（RNP基因）结果判断1+报告结果为阴性2+报告结果为阳性3+ORFlab基因阳性，需复检4+N基因阳性，需复检5一样本不合格，建议复检11. 3灰区样本复测:取300 1样本重新提取核酸进行莫测，复测结果与第一次结果一致或两个通道均CT值W38.0则结果判读为阳性，否则为阴性。11.4单基因阳性复测：如果是痰液样本:复测结果与第一次结果一致或两个通道均CT值W38. 0则结果判读为阳性，否则为阴性；咽拭子：建议采集痰液样本进行复测，复测结果与第一次结果一致或两个通道均C

7、T值W38. 0则结果判读为阳性，否则为阴性。11 . 5检验方法的局限性本试剂盒检测的靶序列为2019-nCoV的ORFlab与N基因的保守序列，该基因在各毒株间都是高度保守且很稳定。但如果在靶序列处发生基因突变，则有可能造成假阴性结果，即发生漏检。12 .性能指标12.1 阳性/阴性参考品符合率：使用国家参考品或企业阳性/阴性参考品进行检测，结果符合国家参考品规定或企业阳性/阴性参考品检测结果。12.2 精密性：使用国家参考品或企业精密性参考品检测，结果符合国家参考品规定或企业精密性参考品检测结果：CT值的CV%229E HKU1；甲型流感病毒 H1N1 (2009)、季节性 H1N1、H

8、3N2、H5N1、II7N9；乙型流感Yamagata、Victoria；副流感1、2、3；鼻病毒A、B、C；呼吸道合胞病毒A、B；腺病毒1、2、3、4、5、7、55型、肠道病毒CA6、CAIO、CB5、EVD68、脊髓灰质炎3型、人偏肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、轮状病毒B型、诺如病毒型、水痘-带状疱疹病毒、肺炎支原体、肺炎依原体、嗜肺军团菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、烟曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌及人类基因组DNA无交叉反应。对lmgd粘蛋白、5%人血液、0.2 mg/L地塞米松、0.2 mg/L扎那米韦、2m

9、gL利巴韦林、50mgL奥司他韦、2gml妥布霉素等均无干扰。13 .生物参考区间阴性。14 .干扰反应(或污染源)114. 1样本之间污染。14 . 2试剂、耗材(如Tip头)、设备(移液器、离心机、扩增仪等)污染。15 . 3产物及其他质粒污染。16 .安全防护措施具体请参见新冠核酸检测质量与安全管理手册、生物安全管理手册。17 .临床意义体外定性检测新型冠状病毒感染的肺炎疑似病例、疑似聚集性病例患者、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的咽拭子、痰液样本中、新型冠状病毒(2019-nCoV)ORFlab和N基因。该检测可用于2019年12月以来，新型冠状病毒(2019-CoV)感

10、染的肺炎疫情期间，相关病例的辅助诊断和此次疫情的体外诊断应急储备。18 .相关文件18.1 新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)产品说明书。17. 2全国临床检验操作规程(第4版)。17.3 新冠核酸检测质量与安全管理手册17.4 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法17.5 医学实验室质量和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明(CNAS)17.6 生物安全管理手册18.相关记录18. 1 YCXZYYJYK-JL-SOP_18-17-01 附表 16 可接受标本记录表18.3 YCXZYYJYK-JL-S0P,18-17-02 附表 17 拒收标本记录表18.4 YCXZYYJYK-JL-S0P.18-35-01 附表 21 PCR 实验室流程图