新冠核酸检测扩增检测操作规程(达安红盒).docx
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1、SOP 18-35新型冠状病毒2019-CoV基因(达安红盒)扩增检测操作规程1 .名称新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)2 .目的规范新型冠状病毒(2019-nCoV) RNA荧光定性PCR项目检测试验,确保检测结果的准确性和重复性。3 .方法TaqMan探针实时荧光定性。4 .检测原理基于一步法RT-PCR技术,选取2019新型冠状病毒(2019-nCoV) ORFlab和N基因作为扩增靶区域,设计特异性引物及荧光探针(N基因探针采用FAM标记,ORFlab探针采用V1C标记)用于标本中2019新型冠状病毒RA的检测;同时包括内源性内标检测系统(内标基因探针采用C
2、y5标记),用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控,可减少假阴性结果的出现。5 .样品咽拭子、痰液等6 .试剂中山大学达安基因股份有限公司组分名称规格数量主要成分PCR检测试剂(大包装,96人份/盒)2019-nCoV PCR 反应液 A918PL/管2特异性引物、探针、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液2019-nCoV PCR 反应液 B204L管2热启动Taq抗体酶、Taq酶、C-NfMLV 酶、dNTPs、UDG 酶、RNasin2019-nCoV阴性质控品450ML/2含2019-nCoV内标片段(RNase P基因)的假病毒、TENC(ORFlab)阳性质控品400ul管2含
3、2019-nCoV目的片段的假病毒、含2019-nCoV内标片段(RNase P基因)的假病毒、TE7.仪器苏州雅睿生物技术有限公司MA-6000实时荧光定量PCR仪。8 .操作步骤9 . 1 PCR试剂准备(I区)8. 1. 1从试剂盒中取出2019-nCoV PCR反应液A、2019-nCoV PCR反应液B ,室温融化后振荡混匀,掌上离心机离心10秒后使用。8. 1.2取N个(N=待测样本个数+NC(0RFlabN)阴性质控品+NC(0RFlabN)阳性质控品)PCR反应管将各组分充分混合后进行短时离心,以使管壁上的液体全部离心至管底,之后将20ul扩增体系分装到PCR管中。将装有PCR
4、反应液的PCR管置I区区传递窗。NC单人份扩增体系配制如下表:2019-nCoV PCR 反应液 A2019-nCoV PCR 反应液 B扩增体系17ul3ul20ul8. 1.3试剂准备区清洁:每次完成配液操作后,用75%的酒精清洁实验室台面,用2000mgL含氯消毒剂清洁实验室地面,打开实验室紫外线,人员退出实验室。8. 2核酸模板提取(II区)核酸提取:取200ul液态样本进行核酸提取。采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取或纯化试剂盒;具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。8. 3加样(H区)在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测标本核酸、阳性质控品、弱阳性质控
5、品各5ul,盖紧管盖,6,000rpm离心数秒后,置区I区传递窗。标本制备区清洁:每次完成试验操作后,医疗垃圾用2000mgL含氯消毒剂喷洒至完全湿润,用鹅颈式封扎,带出二区高压处理后按规范处置。用75%的酒精清洁实验室台而,用2000mgL含氯消毒剂清洁实验室地面,打开实验室紫外线,人员退出实验室。8. 4PCR扩增检测(I区)8 . 4. 1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。9 . 4. 2循环参数设定:序号步骤温度时间循环数1反转录反应502分钟循环1次2预变性952分钟循环1次3变性955秒循环10次退火、延伸6035秒4变性955秒循环32次退火、延伸及检测荧光6035
6、秒8. 4. 3样品设置在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型。10 结果分析选择定性分析模式,自动调整阈值,必要时可手工设定,以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点,且Ct值不出现任何数值为准,也可根据仪器的实际情况进行调整。11 .质控标准10. 1 2019-nCoV阴性质控品:FAM和V1C检测通道无Ct值或无明显扩增曲线,Cy5 通道 CtW25;10.2 2019-nCoV阳性质控品:FAM和VTC检测通道Ct值22;10.3 以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。10.4 每批上样检测应当在剩余加样孔中设置1个弱阳性质
7、控样本和三个阴性质控样本(2份生理盐水和1份阴性混合样本)。3份阴性质控样本随机放在临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性,3个阴性质控全部测定为阴性,视为在控。反之,则为失控,不可发出报告,应分析原因,必要时重新检测样本。11.结果判断FAM 通道(green)N基因VIC 通道(yellow)ORFlab基因Cy5 通道(Red)内标(RNase P基因)结果判定Ct 值30或无Ct值Ct 值30或无Ct值Ct 值W30阴性Ct 值30Ct 值W30有或无扩增曲线阳性Ct 值30Ct 值30或无Ct值有或无扩增曲线复检:内标Ct值30或无扩增曲线样本需重新取样检测;内标Cl值30样本可对已提取
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